Name: Un método simple de tubo de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda un método de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina. Esta técnica accesible permite tratar trastornos musculoesqueléticos en caballos con equipamiento básico de laboratorio.

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Este estudio se realizó de acuerdo con los protocolos internos para la preparación y uso de PRP en caballos en el Hospital Veterinario Docente de la Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Este estudio no requirió la aprobación del Comité Interno de Cuidado de Animales ya que los datos se obtuvieron de caballos cojos tratados clínicamente en nuestra institución. Para desarrollar este protocolo se utilizaron datos de seis caballos criollos colombianos, tres yeguas y tres castrados, con una edad promedio de 7,4 (± 2,6) años. Los propietarios de los caballos fueron informados de la naturaleza del estudio y firmaron un consentimiento informado. Todos los caballos incluidos en el estudio estaban clínicamente sanos, excepto por el problema musculoesquelético que se estaba tratando. Solo se incluyeron animales con un recuento basal de plaquetas superior a 100 × 103/mL de sangre total. Es importante tener en cuenta que los caballos con concentraciones plaquetarias más bajas pueden considerarse trombocitopénicos14. Además, estos animales exhibieron recuentos sanguíneos normales, parámetros bioquímicos clínicos hepáticos y renales y valores de análisis de orina dentro del rango normal para la especie equina.
1. Restricción de caballos y desinfección de la piel
<ol>
	<li>Para la seguridad tanto del caballo como del veterinario, sujete al caballo (Eqqus caballus) de forma segura en un conducto de examen clínico o con una brida (Figura 1A), dependiendo del comportamiento del animal. A continuación, recorte un área de cabello de 5 cm x 5 cm con una afeitadora eléctrica en el tercio medio de un lado del cuello, sobre la vena yugular. NOTA: Algunos propietarios prefieren que el caballo no sea recortado. Un estudio indica que el corte del cabello en el sitio de la venopunción no es necesario para prevenir la contaminación bacteriana de P-PRP21. Por lo tanto, este procedimiento queda a discreción del veterinario.</li>
	<li>Realice una preparación preliminar de la piel no estéril sobre el área recortada de la vena yugular durante al menos 10 cm con una gasa no estéril y guantes durante aproximadamente 3 min. Aplicar varias gasas empapadas en espuma antiséptica en forma circular (Figura 1B).</li>
	<li>Prepare el sitio de venopunción asépticamente usando guantes estériles y gasas empapadas en desinfectante. Frote la piel en el área del cuello con movimientos circulares durante aproximadamente 5 min. Limpie el área con una gasa estéril empapada en alcohol etílico al 95%.</li>
</ol>
2. Extracción de sangre aséptica
<ol>
	<li>Coloque 16 tubos de citrato de sodio de 4,5 ml, previamente limpiados con una gasa empapada en alcohol etílico al 95%, en una rejilla de plástico limpia. Impregne las tapas de goma de los tubos de vacío con alcohol etílico al 95%, especialmente en el hueco para el acoplamiento de la aguja. NOTA: En general, se requieren ocho tubos de citrato de sodio de 4,5 ml para obtener 2,5 ml de PRP. El número de tubos utilizados en un caso particular dependerá de los tejidos blandos o de la articulación específica que se esté tratando.</li>
	<li>Inserte estérilmente una aguja de mariposa en el sitio yugular desinfectado (Figura 2A) y conecte tubos de citrato de sodio de 4,5 ml al soporte (Figura 2B). Agite suavemente los tubos y colóquelos en una rejilla de plástico. NOTA: Se utiliza un tubo de citrato de sodio de 4,5 ml para hemogramas automatizados y para preparar plasma después de la centrifugación de centrifugación dura. Este plasma se utiliza luego como control negativo para las comparaciones de factor de crecimiento y enriquecimiento de citoquinas con PRP.</li>
</ol>
3. Obtención de plasma rico en plaquetas
<ol>
	<li>Coloque los tubos de citrato de sodio de 4,5 ml que contienen sangre completa en un rotor basculante de cuatro posiciones en un ángulo de 90° en una centrífuga de banco. Centrifugar los tubos a 120 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, coloque los tubos de 4,5 ml que contienen sangre citratada y dos tubos lisos adicionales de 10 ml en una gradilla y coloque la gradilla en el lado no dominante de la mano del operador dentro de una campana de flujo laminar de clase II sobre una cortina estéril e impermeable. NOTA: Un estudio sugiere que una campana de flujo laminar de Clase II no es esencial para prevenir la contaminación bacteriana durante la adquisición de PRP21. En cambio, el PRP se puede preparar en una sala limpia libre de corrientes de aire y polvo. En este escenario, la rejilla del tubo de sangre se puede colocar sobre una mesa cubierta con un paño estéril e impermeable.</li>
	<li>Primera centrifugación: Con una mascarilla y guantes estériles, coloque una jeringa luer estéril de 10 ml junto con una aguja estéril (21 G 5/8") en el lado dominante de la mano en el interior de la campana de flujo laminar. NOTA: A partir de este momento, la mano enguantada dominante siempre permanece estéril, mientras que las tapas de goma de los tubos de citrato de sodio deben retirarse con la mano no dominante enguantada.</li>
	<li>Inserte la aguja estéril en cada tubo de sangre citratada centrifugado 3 mm sobre la capa leucocitaria (Figura 3A) y aspire suavemente el 50% de la fracción plasmática, evitando turbulencias de líquidos y aspiración de sangre. Una vez aspirados 10 ml de plasma de cuatro tubos de 4,5 ml, distribúyalo en tubos planos estériles de 5 a 10 ml (Figura 3B). NOTA: Retire las tapas de goma de estos tubos con la mano no dominante y colóquelos sobre un sitio estéril de la cortina o sosténgalos para evitar la contaminación bacteriana.</li>
	<li>Segunda centrifugación: vuelva a cerrar los tubos con los tapones de goma y colóquelos en un estado equilibrado en un rotor basculante de cuatro posiciones en un ángulo de 90° en la centrífuga de sobremesa y centrifugue estos tubos a 240 × g durante 5 min a temperatura ambiente. NOTA: La elección de la fuerza de centrifugación relativa (RCF o g) se basa en un estudio seminal14 que describió por primera vez este método para obtener PRP a partir de sangre equina. Además, este método ha sido evaluado para su reproducibilidad por otros autores22.</li>
	<li>Coloque los tubos en una gradilla y colóquelos en el lado no dominante dentro de la campana de flujo laminar de clase II, encima de la cortina impermeable, estéril e impermeable previamente colocada.</li>
	<li>Use la mano no dominante para quitar las tapas de goma y la mano dominante estéril para aspirar lentamente el primer 75% del plasma usando una aguja espinal de 18 G y 90 mm conectada a una jeringa luer estéril de 10 ml (Figura 3C). Deseche esta jeringa o resérvela para otros usos experimentales o clínicos, ya que contiene plasma pobre en plaquetas (PPP). A continuación, conecte la aguja espinal estéril utilizada anteriormente a una jeringa luer estéril de 5 o 10 ml para aspirar el plasma restante (25%) del tubo liso estéril de 5 a 10 ml. Esta fracción se conoce como P-PRP (Figura 3D). NOTA: En determinadas condiciones clínicas y experimentales, se utiliza una alícuota de 0,5-1 ml de PRP para hemogramas automatizados seguidos de análisis del factor de crecimiento (TGF-β1 y PDGF-BB) mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. La medición de estos mediadores puede realizarse 3 h después de la activación del P-PRP con sales de calcio o trombina23 o después de inducir daño celular por cambio de temperatura o la adición de detergentes no iónicos24.</li>
	<li>Envuelva la jeringa Luer estéril que contiene PRP en un paño pequeño e impermeable estéril con una aguja o tapa estéril adjunta para evitar la contaminación bacteriana del producto ortobiológico (Figura 4A). NOTA: La estructura anatómica del caballo a tratar debe prepararse para la inyección aséptica como se describe en la sección 1 de este protocolo. El caballo debe estar adecuadamente sujeto y sedado para minimizar las molestias y garantizar la seguridad tanto del caballo como del veterinario. El producto PRP debe manipularse con guantes y agujas estériles y puede o no activarse según la preferencia del médico (Figura 4B).</li>
</ol>
4. Análisis estadístico
<ol>
	<li>Recopilar datos sobre los recuentos de plaquetas y leucocitos en sangre total y PRP. Evalúe la normalidad de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Si los datos se distribuyen normalmente (P &gt; 0,05), compare y analice los datos de la célula mediante la prueba t. Si los datos de concentración de plaquetas y leucocitos no se distribuyen normalmente (P &lt; 0,05), compare y analice los datos mediante una prueba de Wilcoxon.</li>
	<li>Determinar la concentración de eficiencia plaquetaria y leucocitaria en P-PRP de acuerdo con las siguientes fórmulas25: Eficiencia de recolección de plaquetas = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100 Eficiencia de recolección de leucocitos = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq02.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Recopilar datos de las concentraciones de TGF-β1 y PDGF-BB en sobrenadantes de PRP plasmáticos (control negativo) (después de 3 h de activación con gluconato de calcio) y lisados de PRP obtenidos mediante la adición de una solución detergente no iónica.</li>
	<li>Utilice un modelo mixto lineal generalizado para comparar las concentraciones de factores de crecimiento entre plasma, sobrenadantes de PRP y lisado de PRP. En caso de diferencias estadísticas significativas, aplicar una prueba post-hoc de Tukey.</li>
	<li>Considere p &lt; 0,05 valores estadísticamente significativos para todas las pruebas.</li>
</ol>

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<li>Castillo-Franz, C., López, C., Carmona, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+catabolic+and+anabolic+gene+expression+effects+and+histology+changes+induced+by+platelet-rich+gel+supernatants+in+equine+suspensory+ligament+explants+challenged+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22MLTJ-Muscles+Ligaments+and+Tendons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the catabolic and anabolic gene expression effects and histology changes induced by platelet-rich gel supernatants in equine suspensory ligament explants challenged with lipopolysaccharide.</a> MLTJ-Muscles Ligaments and Tendons. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Argüelles, D., Carmona, J. U., Climent, F., Muñoz, E., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+for+musculoskeletal+lesions+in+five+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment for musculoskeletal lesions in five horses.</a> Vet Rec. 162 (7), 208-211 (2008).</li>
<li>Carmona, J. U., Argüelles, D., Climent, F., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+of+horses+with+osteoarthritis%3A+a+preliminary+pilot+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Equine+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment of horses with osteoarthritis: a preliminary pilot clinical study.</a> J Equine Vet Sci. 27 (4), 167-170 (2007).</li>
<li>Dejnek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+of+blood+cell+components%2C+inflammatory+cytokines+and+growth+factors+in+autologous+platelet-rich+plasma+obtained+by+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Orthop%22%5BJournal%5D)">Content of blood cell components, inflammatory cytokines and growth factors in autologous platelet-rich plasma obtained by various methods.</a> World J Orthop. 13 (6), 587-602 (2022).</li>
<li>Giraldo, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+breed%2C+sex+and+age+on+cellular+content+and+growth+factor+release+from+equine+pure-platelet+rich+plasma+and+pure-platelet+rich+gel%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of the breed, sex and age on cellular content and growth factor release from equine pure-platelet rich plasma and pure-platelet rich gel.</a> BMC Vet Res. 9, 29(2013).</li>
<li>Zimmermann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+technique+and+white+cell+content+influence+the+detectable+levels+of+growth+factors+in+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Sample preparation technique and white cell content influence the detectable levels of growth factors in platelet concentrates.</a> Vox Sang. 85 (4), 283-289 (2003).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de extracción de sangre venosa simple de 10 ml&nbsp;</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos</td><td>Referencia: 366430</td><td>Esto es solo un ejemplo, se pueden usar tubos de otras marcas.</td></tr><tr><td>Tubos de citrato de sodio de 4,5 ml (105 M/3,2%)&nbsp;</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos</td><td>107451</td><td>Esto es solo un ejemplo, se pueden usar tubos de otras marcas.</td></tr><tr><td>Centrífuga de banco</td><td>Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Alemania</td><td></td><td>Se pueden utilizar otras centrífugas de banco.</td></tr><tr><td>Aguja de mariposa (21 G &veces; 0.75 in.) con 12 in. tubo y soporte pre-conectado&nbsp;</td><td>Set de recolección de sangre Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>Referencia 367296</td><td>Este es solo un ejemplo, se pueden usar agujas de mariposa de otras marcas.</td></tr><tr><td>Solución de espuma de clorhexidina al 2,3-4%</td><td></td><td></td><td>La marca o los nombres comerciales de estos productos pueden variar de un país a otro.</td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar de clase II</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td></td><td>Se pueden utilizar otras campanas de flujo laminar de clase II</td></tr><tr><td>Lector ELISA</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico al 95%</td><td></td><td></td><td>La marca o los nombres comerciales de estos productos pueden variar de un país a otro.</td></tr><tr><td>ELISA DuoSet PDGF-BB humano</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EE. UU.</td><td>DY220</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta 1 humano DouSet ELISA</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EE. UU.</td><td>DY240</td><td></td></tr><tr><td>Solución de espuma de povidona yodada al 4-10%</td><td></td><td></td><td>La marca o los nombres comerciales de estos productos pueden variar de un país a otro.</td></tr><tr><td>Software SPSS 25.0</td><td>IBM Corp, SPSS, NY, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas luer estériles de varios volúmenes&nbsp;</td><td>Jeringa Discardit, BD Vacutainer, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td></td><td>Esto es solo un ejemplo, se pueden usar jeringas de otras marcas.</td></tr><tr><td>Aguja espinal estéril (18 G &veces; 90 mm)&nbsp;</td><td>Aguja de espinela BD Quincke, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td></td><td>Este es solo un ejemplo, se pueden usar agujas espinales de otras marcas.</td></tr></tbody></table>

un método simple de tubo de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina

A Simple Double Centrifugation Tube Method to Obtain Platelet-rich Plasma from Equine Blood

El recuento medio de plaquetas (plaquetas × 103/μL) fue significativamente mayor en PRP que en sangre total (p &lt; 0,001). Por el contrario, la concentración media de leucocitos (leucocitos × 103/μL) en PRP fue significativamente menor que la de sangre total (p &lt; 0,001) (Tabla 1). En concreto, el recuento de plaquetas en el PRP fue 2,41 veces mayor que en la sangre total, mientras que la concentración de leucocitos en el PRP fue 0,44 veces menor. La eficiencia de recolección de ...

Un método simple de tubo de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina

Platelet-rich plasma (PRP) is widely utilized as a routine treatment for chronic musculoskeletal conditions in horses, such as osteoarthritis, ...

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Research

Investigación

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Medicine

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Lisado de plaquetas humanas es una rica fuente de factores de crecimiento y un suplemento potente en cultivo celular. Este protocolo se presenta el proceso de preparación de una gran cantidad de lisado de plaquetas humanas, partiendo de plasma rico en plaquetas, la realización de varios ciclos de congelación-descongelación y el agotamiento de los fragmentos de plaquetas.

Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

Este video muestra la preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) de alta calidad mediante la detección del recuento de plaquetas, la recolección y centrifugación de sangre y el aislamiento de plaquetas. Este PRP se utiliza en aplicaciones terapéuticas para la regeneración y cicatrización de tejidos.

Preparación de plasma rico en plaquetas de sangre periférica humana

Describimos una metodología para el procesamiento de sangre total para obtener una variedad de componentes para su posterior análisis. Hemos optimizado un protocolo simplificado que permite el procesamiento simultáneo rápido y de alto rendimiento de muestras de sangre completa en un entorno no clínico.

Fraccionamiento rápida y aislamiento de componentes de sangre total en las muestras obtenidas a partir de una configuración basada en la comunidad

Fibrina rica en leucocitos (L-PRF) representa una preparación aprobada por la FDA de concentrados de plaquetas autólogas que posee una arquitectura de fibrina única, plaquetas enriquecidas y abundantes factores de crecimiento. Aquí, presentamos un protocolo para la generación de L-PRF en el lado del sillón, así como evaluamos sus propiedades mecánicas, incluidas las pruebas uniaxiales y las pruebas de resistencia a la retención de la sutura.

Caracterización de los leucocitos-plaquetas Rich fibrina, una novela de Biomateriales

Se describe un método sencillo para el aislamiento de plaquetas lavadas a partir de sangre humana seguido por mediciones de la agregación plaquetaria inducida por agonistas por turbidimetría. Como un ejemplo aplicamos este método para estudiar la respuesta de agregación de plaquetas humanas a colágeno después de un pre-incubación con el inhibidor de canales Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetría en plaquetas humanas lavadas: El efecto de la Pannexin1-inhibidor de azul brillante FCF sobre la agregación inducida por colágeno

En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.

Purificación de plaquetas de la sangre del ratón

Este protocolo detalla la preparación clínicamente implementable de biomuestras de PBMC y plasma de alta calidad en el sitio del ensayo clínico que se pueden utilizar para el análisis de biomarcadores traslacionales.

Preparación De Pellets De Células Mononucleares De Sangre Periférica Y Plasma De Una Sola Extracción De Sangre En Los Sitios De Ensayos Clínicos Para El Análisis De Biomarcadores

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

El metabolismo de las plaquetas es de interés, particularmente en lo que se refiere al papel de la hiperactividad e hipoactividad plaquetaria en el sangrado y los trastornos trombóticos. El aislamiento de las plaquetas del plasma es necesario para algunos ensayos metabólicos; Aquí se presenta un método para aislar metabolitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

Aprenda un método de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina. Esta técnica accesible permite tratar trastornos musculoesqueléticos en caballos con equipamiento básico de laboratorio.

Un método simple de tubo de doble centrifugación para obtener plasma rico en plaquetas de sangre equina

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