Name: Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-15T11:06:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende el procedimiento de craneotomía con ventana craneal cubierta de vidrio en roedores para imagen cerebral crónica in vivo mediante microscopía de dos fotones. Esta técnica permite observar la corteza neocortical durante períodos prolongados.

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<ol><li> Anestesiar a los ratones con isoflurano (4% para la inducción, 1,5-2% para la cirugía) con IACUC los procedimientos aprobados. Es importante que la cola y / o aprieta los pies se utilizan con el fin de garantizar que el animal está completamente sedado. </li><li> Uso de un optimizador de roedores, se afeitan el pelo de la parte posterior del cuello hasta los ojos. </li><li> Coloque el ratón en un marco estereotáxico, más de una cirugía de agua de recirculación de manta. Sujetar firmemente la cabeza con barras de oído. </li><li> Aplicar pomada para los ojos, con el fin de evitar que el ojo del animal que se sequen. </li><li> Administrar por vía subcutánea, dexametasona (0,2 mg / Kg) y carprofeno (5 mg / Kg) para prevenir la inflamación del cerebro y / o una respuesta inflamatoria, respectivamente. </li><li> Antes de comenzar la cirugía, la esterilización de la zona de trabajo limpiando la piel con tres golpes alternados de 70% de alcohol y betadine. </li><li> Todos los instrumentos quirúrgicos se han pre-esterilizados utilizando un esterilizador de cuentas de vidrio. Con la tijera que han sido esterilizadas con etanol, quitar la piel sobre la parte superior del cráneo, a partir de un corte horizontal a lo largo de la base de la cabeza, seguido por dos cortes en la dirección rostral, casi llegando a los párpados, luego dos cortes oblicuos que convergen en la línea media. </li><li> Una gota de solución de lidocaína con adrenalina + se aplica en este punto en el periostio para evitar el sangrado excesivo o dolor. Con un bisturí, retirar el periostio de los bordes del cráneo. Además, la ligera retracción de la musculatura de la parte posterior del cuello. </li><li> Raspe suavemente toda la superficie expuesta del cráneo con el bisturí para crear una superficie seca. Esto es muy importante, ya que permitirá que el pegamento se adhiera mejor cuando se aplica más tarde. </li><li> Una vez que un sitio de imágenes ha sido elegido, uno está listo para crear la ventana del cráneo. En primer lugar, con suavidad &quot;dibujar&quot; un círculo de unos 4 mm de diámetro con el taladro neumático dental. </li><li> Después de una ligera perforación, aplicar lidocaína solución de epinefrina + nuevo en la superficie del cráneo. Detener la perforación, cuando una capa muy delgada de hueso que queda. Presionando suavemente sobre el centro de la craneotomía para sentir cómo se le da forma, por lo general se puede saber que se alcanza esta etapa. </li><li> En una gota de solución salina y las ventajas de tomar de las trabéculas óseas - la estructura esponjosa del hueso - elevación de distancia de la craneotomía en el cráneo con unas pinzas punta muy fina. La solución salina es importante, ya que ayudará a levantar la cabeza y evitar el sangrado de la duramadre. </li><li> Aplicar Gelfoam que ha sido previamente lavadas con solución salina a la duramadre para detener cualquier sangrado pequeño que a veces ocurre cuando el cráneo es removido. </li><li> Después de secar la superficie de la duramadre y la garantía de que no hay sangrado, mucho cuidado, coloque un recipiente estéril de vidrio de 5 mm hoja de la cubierta en la parte superior de la duramadre. (Nota: otros grupos también se coloca una gota de bajo punto de fusión de agarosa (1,2%) a lo largo de la dura y poner el cubreobjetos en la parte superior del agar). </li><li> Aplique una gota de pegamento a base de cianoacrilato para el hemisferio opuesto en el cráneo. Con la ayuda de una aguja, aplique el pegamento alrededor de la ventana, mientras que teniendo cuidado de no ponerlo en el vaso. Pegue ahora se puede aplicar en una capa fina sobre toda la superficie del cráneo. </li><li> Una vez que el pegamento se haya secado, mezcla de acrílico dental y aplicarlo en toda la superficie del cráneo, que abarca también un pequeño borde de la hoja de la cubierta, para asegurarla. </li><li> Después de obtener la hoja de la cubierta, hacer un pequeño pozo alrededor de la ventana con acrílico dental. Además, integrar una barra de titanio en el acrílico dental. Esta barra se utilizarán posteriormente para conectar el ratón con seguridad en la platina del microscopio para obtener imágenes. Es importante asegurarse de que el bar está a nivel, de modo que sea paralelo a la ventana del cráneo. Colocar una hoja de papel debajo de la barra se puede permitir que la barra de permanecer nivel, mientras que el acrílico se endurezca. </li><li> El acrílico dental se deja curar (endurecer) durante 10 minutos, momento en que la barra de titanio se fija en su lugar. Colocar el animal en una jaula caliente hasta que se recupere. </li><li> Después de la recuperación de la anestesia, el animal se pueden obtener imágenes en el mismo día. </li></ol>

<ol><li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)"> In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 85, 161-165 (1997).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404, 876-881 (2000).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+and+cell-type-specific+spine+growth+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex.</a> Nature. 441, 979-983 (2006).</li>
</ol>

Como hemos mostrado en el video y en las figuras complementarias, la preparación de la ventana del cráneo, combinada con el uso de la microscopia de dos fotones, es una herramienta muy poderosa para estudiar in vivo la estructura y función del neocórtex. La técnica requiere de un riguroso entrenamiento para familiarizarse con la anatomía pertinente y los procedimientos quirúrgicos muy bien y las habilidades que requiere esta preparación. Sólo cirugías originales pueden ser utilizados para obtener imágenes de crónica. Si la duración es manip...

un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Las técnicas de imagen son cada vez más importante en la función cerebral de estudio. Entre ellos, dos fotones microscopía de escaneo láser se ha convertido en un método muy útil, porque permite el estudio del cerebro intacto en vivo. Con los preparativos adecuados, esta técnica permite la observación de la zona cortical misma crónica, de minutos a meses. En este vídeo, se muestra una preparación para la crónica en imágenes in vivo del cerebro usando la microscopía de dos fotones. Esta técnica fue inicialmente promovida por el Dr. Karel Svoboda, quien es ahora un Howard Hughes Medical Institute en la Granja Janelia. Preparaciones como la que se muestra aquí se puede utilizar para obtener imágenes de la estructura neocortical (por ejemplo, la dinámica, dendríticas y axonal), para registrar la actividad neuronal con tintes sensibles al calcio, a la imagen de la dinámica del flujo sanguíneo cortical, o para los estudios de imagen óptica intrínseca. Imágenes profundas de la corteza cerebral es posible con óptima cirugías ventana craneal. Operando bajo las condiciones más estériles posible para evitar infecciones, junto con el uso de un cuidado extremo para no dañar la duramadre durante la cirugía, se traducirá en éxito y duradera cubierta de cristal y craneal.

Este video y el protocolo de demostrar cómo la implantación de una cubierta de cristal ventana craneal en los roedores. Estas preparaciones se pueden utilizar para la crónica en vivo de dos fotones de imágenes de la corteza cerebral en escalas de tiempo de meses. También puede ser utilizado para otros tipos de imágenes, incluyendo imágenes ópticas señal intrínseca.

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Las técnicas de imagen son cada vez más importantes en el estudio de la función cerebral. Entre ellas, la microscopía de barrido láser de dos fotones ha surgido como una...

Las técnicas de imagen están volviéndose cada vez más importantes en el estudio de la función cerebral. Entre ellas, la microscopía láser de dos fotones ha surgido como un método extremadamente útil porque permite el estudio del cerebro de la hormiga viva y, con preparaciones adecuadas, la observación crónica de la misma área cortical desde minutos hasta meses.En este video, mostramos una preparación para la obtención de imágenes crónicas in vivo del cerebro mediante microscopía de dos fotones. La preparación de ventana craneal que demostraremos hoy fue desarrollada inicialmente por el Dr. Carl Voda, investigador del Instituto Médico Howard Hughes en Janelia Farm. Hola y Ricardo Must, del laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Universidad de California en Los Ángeles.Hoy vamos a mostrarle el procedimiento para crear una ventana craneal para imágenes crónicas in vivo. Esta preparación es muy útil porque permite obtener imágenes en profundidad dentro del cerebro mediante un microscopio láser de dos fotones. Así que comencemos.Antes de comenzar la cirugía, los ratones se anestesian con isoflurano: 4 % para inducción y de 1,5 a 2 % para la cirugía, siguiendo procedimientos aprobados por el IACUC. Es importante utilizar pellizcos en la cola y/o en los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente sedado. Con una afeitadora para roedores, se afeita el pelo desde la parte posterior del cuello hasta los ojos.Tras afeitar, se coloca al ratón en un marco estereotáxico, sobre una manta con recirculación de agua ajustada a 37 grados Celsius, y se sujeta firmemente la cabeza utilizando barras para las orejas. A continuación, se aplica una pomada oftálmica para evitar que se seque el ojo del animal. Después, se administran subcutáneamente dexametasona, 0,2 miligramos por kilogramo, y carprofeno, cinco miligramos por kilogramo.Con el fin de prevenir respectivamente la hinchazón del cerebro y una respuesta inflamatoria. Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de esterilizar el área operatoria limpiando la piel con tres hisopos alternados de alcohol al 70 % y Betadine. Todos los instrumentos quirúrgicos han sido previamente esterilizados utilizando un esterilizador de perlas de vidrio, empleando tijeras que han sido rociadas con etanol.Se retira la piel de la parte superior del cráneo, comenzando con un corte horizontal a lo largo de la base de la cabeza, seguido de dos cortes en dirección rostral, casi hasta alcanzar los párpados. Luego, dos cortes oblicuos que convergen en la línea media. En este punto, se aplica una gota de solución de lidocaína y epinefrina sobre el periostio para evitar sangrado excesivo o dolor; con un bisturí, se retrae el periostio hacia los bordes del cráneo.La musculatura de la parte posterior del cuello también se retrae ligeramente. Luego, se raspa suavemente con un escalpelo toda el área expuesta del cráneo para crear una superficie seca. Esto es muy importante porque permitirá que el pegamento se adhiera mejor cuando se aplique posteriormente.Una vez que se ha elegido un sitio de imagen, se está listo para crear primero la ventana craneal. Se dibuja suavemente un círculo de aproximadamente cuatro milímetros de diámetro con una fresa neumática dental. Después de una ligera perforación, se aplica nuevamente solución de lidocaína con epinefrina sobre la superficie del cráneo.Se detiene la perforación cuando queda una capa muy delgada de hueso, generalmente un tabique nasal. Esta etapa se alcanza empujando suavemente el centro de la craneotomía para percibir cómo cede bajo una gota de solución salina y aprovechando la trabea ósea, una estructura esponjosa del hueso.La craneotomía se levanta del cráneo con pinzas de punta muy fina. La solución salina es importante porque ayudará a levantar el cráneo y prevenirá el sangrado de la duramadre. A continuación, se aplica espuma de gel, previamente empapada en solución salina, sobre la duramadre para detener cualquier pequeño sangrado que a veces ocurre al retirar el cráneo.Después de secar la superficie de la duramadre y asegurarse de que no haya sangrado, se coloca suavemente una cubreobjetos estéril de cinco milímetros encima de la duramadre. Se aplica una gota de pegamento a base de cianoacrilato en el hemisferio opuesto del cráneo. Con la ayuda de una aguja, se aplica el pegamento suavemente alrededor de toda la ventana, teniendo cuidado de no colocarlo debajo del vidrio.Ahora se puede aplicar una capa delgada de pegamento sobre toda la superficie del cráneo. Una vez que el pegamento se ha secado, se mezcla y aplica acrílico dental sobre toda la superficie del cráneo, cubriendo también un pequeño borde de la lámina de cubierta para asegurarla. Después de fijar la lámina de cubierta, se forma un pequeño pozo alrededor de la ventana con acrílico dental.Una barra de titanio también está incrustada en el acrílico dental. Esta barra se utilizará posteriormente para fijar al ratón de forma segura sobre la platina del microscopio. Para la obtención de imágenes, es importante asegurarse de que la barra esté nivelada, de modo que quede paralela a una ventana craneal.Colocar un trozo de papel debajo de la barra puede permitir que esta permanezca nivelada mientras el acrílico se endurece; se deja que el acrílico dental cure o se endurezca durante 10 minutos, momento en el cual la barra de titanio ha quedado fijada en su lugar. Luego, el animal se coloca en una jaula caliente hasta que se recupere. Después de la recuperación de la anestesia, el animal puede ser sometido a imágenes el mismo día.Esta película muestra una serie de 160 imágenes tomadas a intervalos de cinco micrones con nuestro microscopio personalizado de dos fotones a través de una ventana craneal colocada sobre la corteza somatosensorial de un ratón GFPM de tres meses de edad. Esta línea transgénica de ratones expresa GFP en un pequeño subconjunto de neuronas parietales. En la capa cinco y la capa dos tres, la imagen se obtuvo con un objetivo de inmersión en agua de 40 x y una apertura numérica de 0,8, utilizando una longitud de onda de excitación de 910 nanómetros.En las imágenes más superficiales, es fácil reconocer los arborizaciones dendríticas de las dendritas apicales de las células parametales. La ramificación apical de las dendritas de cada neurona converge en una única dendrita apical grande. También pueden observarse dendritas oblicuas más pequeñas que emergen de esta dendrita apical principal; asimismo, son evidentes axones que cruzan el campo de visión.Esta es una pila de 12 imágenes tomadas cada uno coma cinco micrómetros utilizando el mismo objetivo de 40x con mayor aumento, en la que se muestra una dendrita superficial con resolución suficientemente alta como para distinguir espinas dendríticas individuales. Acabamos de mostrarle cómo realizar una preparación de ventana craneal para imágenes crónicas del cerebro mediante microscopía óptica. Este es un método sumamente poderoso para el estudio del cerebro porque permite investigar tanto la estructura como la función del cerebro en vida, no solo en una sola imagen, sino también de forma crónica mediante múltiples imágenes durante períodos de meses.Otra ventaja de la preparación de la ventana craneal es que se puede obtener un campo de visión amplio, lo que permite imaginar estructuras grandes como una acción completa o el árbol dentado a lo largo de varios milímetros. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar en las condiciones más limpias y estériles posibles y tener una mano muy firme. Bien, y eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

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