Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Las técnicas de imagen son cada vez más importantes en el estudio de la función cerebral. Entre ellos, dos microscopías láser de fotones han surgido como un método extremadamente útil porque permite el estudio del cerebro anta vivo y con las preparaciones adecuadas. Esta técnica permite la observación de la misma área cortical de forma crónica desde minutos hasta meses.

En este vídeo, mostramos una preparación para la obtención de imágenes crónicas in vivo del cerebro utilizando dos fotomicroscopías. El Dr. Carl Voda, investigador del Instituto Médico Howard Hughes en Janelia Farm, inicialmente fue pionero en la preparación de la ventana craneal que demostraremos hoy. Hola Y Ricardo debe del laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Universidad de California en Los Ángeles.

Hoy vamos a mostrarte el procedimiento para crear una ventana craneal para la obtención de imágenes crónicas in vivo. Esta preparación es muy útil porque permite obtener imágenes profundas del interior del cerebro utilizando un microscopio láser de fotones. Así que comencemos.

Antes de comenzar la cirugía, los ratones se anestesian con flúor. 4% para la inducción, un punto medio a 2%para la cirugía, utilizando procedimientos aprobados por I-A-C-U-C, es importante usar pinzamientos en la cola y/o los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente sedado. Con una recortadora de roedores, se afeita el vello desde la parte posterior del cuello hasta los ojos.

Después del afeitado, el ratón se coloca en un marco estereotáxico, descansando sobre una manta de recirculación de agua A 37 grados centígrados, la cabeza se asegura firmemente con barras para los oídos. A continuación, se aplica una pomada ocular para evitar que el ojo del animal se seque. A continuación, se administra dexametasona (0,2 miligramos por kilogramo) y carprofeno (cinco miligramos por kilogramo) por vía subcutánea.

Con el fin de prevenir la inflamación del cerebro y/o una respuesta inflamatoria, respectivamente. Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de esterilizar el área operatoria limpiando la piel con tres hisopos alternos de alcohol al 70% y Betadine. Todos los instrumentos quirúrgicos han sido preesterilizados con un esterilizador de perlas de vidrio con tijeras que han sido rociadas con etanol.

Se retira la piel sobre la parte superior del cráneo, comenzando con un corte horizontal a lo largo de la base de la cabeza, seguido de dos cortes en la dirección rostral, casi llegando a los párpados. A continuación, dos cortes oblicuos que convergen en la línea media. En este punto, se aplica una gota de solución de lidocaína y epinefrina sobre el periostio para evitar sangrado excesivo o dolor con un bisturí, el periostio se retrae hacia los bordes del cráneo.

La musculatura de la nuca también está ligeramente retraída. A continuación, se raspa suavemente toda la zona expuesta del cráneo con un bisturí para crear una superficie seca. Esto es muy importante porque permitirá que el pegamento se adhiera mejor cuando se aplique posteriormente.

Una vez que se ha elegido un sitio de imagen, primero se está listo para crear la ventana craneal. Un círculo de unos cuatro milímetros de diámetro se dibuja suavemente con un taladro dental neumático. Después de una ligera perforación, se vuelve a aplicar una solución de lidocaína epinefrina sobre la superficie del cráneo.

La perforación se detiene cuando queda una capa muy delgada de hueso, generalmente una nariz. A esta etapa se llega empujando suavemente el centro de su craneotomía para sentir cómo cede bajo una gota de suero fisiológico y aprovechando la trabécula ósea. Estructura esponjosa del hueso.

La craneotomía se levanta del cráneo con pinzas de punta muy fina. La solución salina es importante porque ayudará a levantar el cráneo y evitará el sangrado de la duramadre. A continuación, se aplica a la duramadre espuma previamente empapada en solución salina para detener cualquier pequeño sangrado que a veces se produce cuando se extrae el cráneo.

Después de secar la superficie de la duramadre y asegurarse de que no haya sangrado, se coloca suavemente una cubierta de vidrio estéril de cinco milímetros sobre la duramadre. Se aplica una gota de pegamento a base de cianoacrilato en el hemisferio opuesto del cráneo. Con la ayuda de una aguja, el pegamento se aplica suavemente alrededor de la ventana con cuidado de no ponerlo debajo del vidrio.

El pegamento ahora se puede aplicar en una capa delgada sobre toda la superficie del cráneo. Una vez que el pegamento se ha secado, se mezcla el acrílico dental y se aplica por toda la superficie del cráneo, cubriendo también un pequeño borde del cubreobjetos para asegurarlo. Después de asegurar el cubreobjetos, se hace un pequeño pozo alrededor de la ventana con acrílico dental.

Una barra de titanio también está incrustada en el acrílico dental. Esta barra se utilizará posteriormente para fijar el ratón de forma segura a la platina del microscopio. Para la obtención de imágenes, es importante asegurarse de que la barra esté nivelada de modo que quede paralela a una ventana craneal.

Colocar un trozo de papel debajo de la barra puede permitir que la barra permanezca nivelada mientras el acrílico se endurece, se deja que el acrílico dental se cure o endurezca durante 10 minutos, momento en el que la barra de titanio se ha fijado en su lugar. Luego, el animal se coloca en una jaula caliente hasta que se recupere. Después de la recuperación de la anestesia, el animal puede ser fotografiado el mismo día.

Esta película muestra una pila de 160 imágenes tomadas a intervalos de cinco micras con nuestro microscopio de dos fotones personalizado a través de una ventana craneal colocada sobre la corteza somatosensorial de un ratón GFPM de tres meses de edad. Esta línea transgénica de ratones expresa GFP en un pequeño subconjunto de neuronas parmal. En la capa cinco y la capa dos tres, la imagen se tomó con un objetivo de inmersión en agua de 40x con una apertura numérica de 0,8 utilizando una longitud de onda de excitación de 910 nanómetros.

En las imágenes más superficiales, es fácil reconocer los árboles dendríticos de las dendritas apicales de las células parametálicas. El penacho apical de las dendritas de cada neurona converge en una sola dendrita apical grande. También se pueden ver dendritas oblicuas más pequeñas que se desprenden de esta dendrita apical principal, también son evidentes los axones que cruzan el campo de visión.

Se trata de una pila de 12 imágenes que toman cada micra y media utilizando el mismo objetivo de 40x con mayor aumento, una dendrita superficial se muestra con una resolución lo suficientemente alta como para resolver las espinas dendríticas individuales. Acabamos de mostrarle cómo realizar una preparación de la ventana craneal para la obtención de imágenes crónicas del cerebro mediante fotomicroscopía. Este es un método extremadamente poderoso para el estudio del cerebro porque le permite estudiar tanto la estructura como la función del cerebro vivo, no solo en una sola imaginación, sino también crónicamente a través de múltiples imaginaciones durante períodos de meses.

Otra ventaja de la preparación de la ventana craneal es que se puede obtener una imagen de un gran relleno de visión, lo que permite obtener imágenes de grandes estructuras, como una acción completa o el cenador inri en un lapso de milímetros. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar en las condiciones más limpias y estériles posibles y tener una mano muy firme. Bien, y eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.