Name: Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda el ensayo de intercambio de lípidos en células vivas utilizando ciclodextrina para estudiar la localización y activación de receptores tirosina quinasa. Este método permite analizar la dinámica de microdominios lipídicos en membranas plasmáticas.

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<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%2C+detergent-resistant+membranes%2C+and+raft+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.</a> Physiology. 21, 430-439 (2006).</li>
<li>Schroeder, R., London, E., Brown, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+saturated+acyl+chains+confer+detergent+resistance+on+lipids+and+glycosylphosphatidylinositol+%28GPI%29-anchored+proteins%3A+GPI-anchored+proteins+in+liposomes+and+cells+show+similar+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).</li>
<li>Suresh, P., Miller, W. T., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+exchange+shows+insulin+receptor+activity+is+supported+by+both+the+propensity+to+form+wide+bilayers+and+ordered+raft+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).</li>
<li>Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+structure+dependence+of+insulin+receptor+and+insulin-like+growth+factor+1+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).</li>
<li>Zidovetzki, R., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cyclodextrins+to+manipulate+plasma+membrane+cholesterol+content%3A+evidence%2C+misconceptions+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).</li>
<li>Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B1-%2C+%CE%B2-+and+%CE%B3-cyclodextrins+on+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes.</a> Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cyclodextrin-induced+lipid+substitution+to+study+membrane+lipid+and+ordered+membrane+domain+%28raft%29+function+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+replacement+of+plasma+membrane+outer+leaflet+phospholipids+and+sphingolipids+in+cells+with+exogenous+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).</li>
<li>Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+replacements+within+the+tetrabasic+cleavage+site+on+the+processing+of+the+human+insulin+receptor+precursor+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid+structure+and+raft+domains+in+living+cells+with+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).</li>
<li>Klymchenko, S., Kreder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells.</a> Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+receptors%2C+lipid+rafts+and+caveolae%3A+An+evolving+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+ActaMol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story.</a> Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+detergent-resistant+membrane+domains%3A+does+phase+separation+occur+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).</li>
<li>Lin, Q., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+plasma+membrane+mimicking+vesicles+with+lipid+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry.</a> PLoS One. 9 (1), e87903(2014).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipid+flippases+can+modulate+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">How lipid flippases can modulate membrane structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).</li>
<li>Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+externalization+of+phosphatidylserine+at+the+cell+surface%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacing+plasma+membrane+outer+leaflet+lipids+with+exogenous+lipid+without+damaging+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity.</a> PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).</li>
<li>Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transbilayer+%28flip-flop%29+lipid+motion+and+lipid+scrambling+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes.</a> FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%CE%B1CD-based+plasma+membrane+outer+leaflet+lipid+exchange+in+mammalian+cells+to+study+insulin+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Approach+Study+Memb+Struct+A+Exp%22%5BJournal%5D)">MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity.</a> Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dilauroyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850335</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td></td><td></td>850355</tr><tr><td>1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC)</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Anti-receptor de insulina y anticuerpo beta;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>CST3025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pYpYpY1162/1163 Anticuerpo receptor de insulina</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>AF2507</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG, tecnología de señalización celular de anticuerpos ligados a HRP</td><td></td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo de vidrio de borosilicato (12 x 75 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielina cerebral (bSM)</td><td>Ávidos polares Avanti</td><td>860062</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielina de huevo (eSM)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino ( FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>G418 sal de disulfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Solución antibiótica-antimicótica (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s medio de águila modificado (DMEM, 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>jamón Gibco' s F12 medios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS) Gibco sin calcio ni magnesio (0,144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0,795 g/L Na2- HPO4 (anhidro))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografía de capa fina de alta resolución (HP-TLC)</td><td>Merck</td><td>HP-TLC Gel de sílice 60 placas</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF Membrana</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Metotrexato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>454126</td><td></td></tr><tr><td>Metil-&alfa;- ciclodextrina (M&alpha; CD)</td><td>AraChem</td><td>CDexA076/BR</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio, activado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5.08605</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Para demostrar el cambio observable en la composición de lípidos celulares después del intercambio, realizamos HP-TLC en células CHO IR después del intercambio de SM cerebral (bSM) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (Figura 1). En los casos en los que se utilizan esfingomielinas como bSM para el intercambio, es evidente un aumento en la intensidad de la banda SM, junto con una disminución en la intensidad de la banda PC en relación con el control no tratado. Por el contrario, al ...

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Los proteoliposomas se utilizan para estudiar canales purificados y transportadores reconstituidos en un entorno bioquímico bien definido. Se ilustra un procedimiento experimental para medir el flujo de eflujo mediado por estas proteínas. Se describen los pasos para preparar los proteoliposomas, realizar los registros y analizar los datos para determinar cuantitativamente las propiedades funcionales de la proteína reconstituida.

Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canales y Transportadores

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Describimos aquí un ensayo fluorométrico sin células bioquímico para la determinación de la peroxidación lipídica HDL. Este ensayo rápido y reproducible puede ser utilizado para determinar la función del HDL en estudios a gran escala y puede contribuir a nuestra comprensión de la función del HDL en enfermedad humana.

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Este protocolo proporciona un enfoque eficiente para medir la absorción de colesterol LDL con tasas de flujo en tiempo real usando un sistema en diversos tipos celulares de imagen vivo de la célula. Esta técnica proporciona una plataforma para la actividad farmacológica de compuestos que afectan flujo de LDL mientras para morfología de la célula y por lo tanto potencial citotoxicidad de la pantalla.

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Presentamos un método para la adquisición de cursos de tiempo reportero de fluorescencia de células individuales utilizando matrices micropatterned. El protocolo describe la preparación de matrices unicelulares, la configuración y el funcionamiento de la microscopía de lapso de tiempo de barrido de células vivas y una herramienta de análisis de imágenes de código abierto para la preselección automatizada, el control visual y el seguimiento de los cursos de tiempo de fluorescencia integrados en...

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

La lipofagia es una forma selectiva de autofagia que implica la degradación de las gotas de lípidos. Las disfunciones en este proceso se asocian con el desarrollo del cáncer. Sin embargo, los mecanismos precisos aún no se comprenden completamente. Este protocolo describe enfoques de imágenes cuantitativas para comprender mejor la interacción entre la autofagia, el metabolismo de los lípidos y la progresión del cáncer.

Explorando la regulación del catabolismo de las gotas lipídicas a través de la lipofagia

En este documento, describimos los protocolos para medir la cantidad de fosfolípidos fluorescentes eliminados específicamente de las partículas donantes de lípidos por la lipoproteína de alta densidad (HDL) presente en el plasma o suero humano completo. Hemos demostrado que esta métrica de la funcionalidad de HDL predice la enfermedad cardiovascular incidente.

Ensayo de salida de fosfolípidos específicos de lipoproteínas de alta densidad

Aprenda el ensayo de intercambio de lípidos en células vivas utilizando ciclodextrina para estudiar la localización y activación de receptores tirosina quinasa. Este método permite analizar la dinámica de microdominios lipídicos en membranas plasmáticas.

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

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