Name: Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica de la ADN polimerasa delta en estructuras G-quadruplex mediante microscopía de fluorescencia de una sola molécula. Este método revela una vía de intercambio novedosa durante la replicación del ADN.

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<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Plantilla de ADN de control de 100 nt</td><td>Tecnologías de ADN</td><td></td> integradas <td>Plantilla de control primario en ensayos de extensión de cebadores</td></tr><tr><td>Plantilla de ADN formadora de G4 de 100 nt</td><td>Tecnologías de ADN</td><td></td> integradas <td>Plantilla de formación primaria de G4 en ensayos de extensión de cebadores</td></tr><tr><td>15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12 pocillos, 20 y micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>Electroforesis en gel</td></tr><tr><td>20 nt Primer oligonucleótido marcado/biotinilado</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>Necesario para la extensión del cebador de las plantillas de 100 nt Plantilla de ADN de control de</td>22 nt Tecnologías de ADN integradas Plantilla de control primario en experimentos de espectroscopía de dicroísmo circular Plantilla de ADN formadora de G4 de 22 nt ADN integrado <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Tecnologías</td><td></td><td>Plantilla primaria de formación de G4 en experimentos de espectroscopía de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 24 x 24 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td>100062 Necesario para la microscopía TIRF</td></tr><tr><td>3-aminopropiltrietoxisilano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>Funcionalización del cubreobjetos</td></tr><tr><td>Láser de 647 nm</td><td>1196627</td><td></td><td>coherente Seleccione la longitud de onda que corresponda a la tinción/tinte de Elección</td></tr><tr><td>Filtro de emisión de 670 nm</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>Garantiza que solo las longitudes de onda relevantes pasen al detector</td></tr><tr><td>Generador de imágenes biomoleculares Amersham Typhoon 5</td> Análisis de <td>29187191</td><td>de Cytiva</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Funcionalización de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Mezcla de solución de trifosfato de desoxinucleótidos</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>Bloques de construcción de replicación</td></tr><tr><td>Baño seco digital (115V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>Soluciones de calefacción</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td>Reducción de enlaces de disulfuro</td></tr><tr><td>Cámara EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>Captura de películas de una sola molécula</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Desnaturalización del ADN durante Ensayos de replicación de ADN por conjuntos</td></tr><tr><td>Jeringa hermética al gas, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>Cubeta de llenado para espectroscopía de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>Microscopio invertido con objetivo de inmersión en aceite CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Facilita la microscopía TIRF de molécula única</td></tr><tr><td>J-810 Espectrofotómetro</td><td>Jasco</td><td>J-810 Medición de</td><td>espectroscopía de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>Funcionalización de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop One Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>Medición de concentraciones de</td></tr> <tr><td>proteínas y etiquetasNeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Anclaje de plantillas de ADN a los cubreobjetos funcionalizados durante experimentos de una sola molécula Tubo de</td></tr><tr><td>polietileno</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>Necesario para la construcción de celdas de flujo</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo, 10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>Contiene muestra para espectroscopía de dicroísmo circular</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>Se utiliza para hacer fluir tampones y sustratos a través de una celda de flujo microfluídica</td></tr><tr><td>Tampón Tris-EDTA</td><td>Tampón de solución de ADN</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td></tr><tr><td>Levadura polimerasa y delta;</td><td>Michael O'Donnell Lab</td><td></td><td>Replicación de las plantillas de ADN</td></tr><tr><td>Columna de desalinización de espín Zeba, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>Purificación de polimerasa</td></tr></tbody></table>

visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la adn polimerasa en g-quadruplex

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

Para este ensayo, se diseñaron dos sustratos de ADN con un cebador de 20 nt marcado con fluorescencia: uno que contenía una secuencia formadora de G4 (Figura 1A, izquierda) y otro que carecía de esta secuencia (Figura 1A, derecha). Para confirmar que el G-quadruplex es un obstáculo eficaz para la actividad de la polimerasa, la síntesis de ADN por Pol δ se monitoreó en un gel desnaturalizante PAGE. La actividad del Pol δ marcado purificado en los sustratos de ADN se examinó mediante electroforesis en gel. La Figura 1B (izquierda) muestra que el Pol δ marcado con fluorescencia es incapaz de sintetizar más allá del G-cuádruple. Antes del inicio de la síntesis (t = 0 min), está presente una banda correspondiente a 20 nt, que representa el cebador marcado que se ha desnaturalizado de la hebra moldura. Después de 3 minutos, esta banda de 20 nt se convirtió en una banda de 60 nt, lo que indica que se produjo la síntesis en todo el ADN y confirmó que la polimerasa estaba completamente bloqueada por la estructura G-quadruplex. Este bloqueo implica que la polimerasa no podría desplegarse ni eludir la estructura. Por el contrario, la síntesis de una plantilla de control que no contiene la secuencia de formación de G-quadruplex (Figura 1A, derecha) produjo una banda de 100 nt después de 3 minutos (Figura 1B, derecha).
Después de confirmar la síntesis en las plantillas y el bloqueo eficiente por el G-quadruplex, estas mediciones se repitieron en un microscopio de fluorescencia de una sola molécula para monitorear el comportamiento de la polimerasa. Las plantillas de ADN se unieron a cubreobjetos funcionalizados (Figura 2A) en una celda de flujo microfluídica, y la posición de cada sustrato se determinó visualizando el cebador marcado con fluorescencia. A continuación, se cargó el δ Pol etiquetado en presencia de dNTP para iniciar la síntesis. Dentro de un campo de visión típico, se rastrean puntos individuales para cuantificar la frecuencia con la que Pol δ se une y se disocia del ADN (Figura 2B, C). Al medir la intensidad en función del tiempo en cada sustrato de ADN, se pueden generar trayectorias de una sola molécula (Figura 2C, Figura 3 suplementaria). Se puede medir la característica "tiempo de permanencia", es decir, la duración media en la que Pol δ permanece ligada a la plantilla. Para el sustrato G4, el tiempo de permanencia se determinó en 6 s ± 2 s, mientras que para el sustrato control fue de 10 s ± 3 s (Figura 2D, Figura 4 suplementaria). Además, para cada trayectoria, se puede cuantificar el número de veces que Pol δ se une a la plantilla. El número de eventos de unión al sustrato G4 es mucho mayor en comparación con la plantilla de control (Figura 2E). Aunque hay instancias de más de un evento de enlace en la plantilla de control debido al enlace y desenlace escolástico, hay un claro aumento en el número de eventos de enlace en promedio para la plantilla de formación G4. Esto sugiere que, después de que la síntesis es detenida por el G-cuádruple, la polimerasa unida se disocia del ADN antes de que las nuevas polimerasas de la solución inicien un ciclo continuo de unión y desunión. Por lo tanto, este ensayo de molécula única proporciona una visión sin precedentes de cómo las ADN polimerasas responden a los obstáculos del ADN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
Figura 1: Ensayo de extensión de cebador conjunto. (A) Representación esquemática de los sustratos de ADN. El sustrato G4 (izquierda) contiene una secuencia de formación de G-cuádruple, mientras que el sustrato de control (derecha) no la contiene. (B) Ensayo conjunto de extensión de la primasa del ADN G4 cebado y sustratos de ADN de control que muestra que la levadura Pol δ marcada con fluorescencia está completamente bloqueada por el G-cuádruple. El gel PAGE muestra la replicación de las plantillas de ADN a lo largo del tiempo, lo que resulta en un cambio del cebador de 20 nt marcado al producto de 60 nt para el sustrato G4 (izquierda) y al producto de 100 nt para la plantilla de control (derecha). M representa una escalera que contiene oligonucleótidos marcados de 20 nt, 60 nt y 100 nt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
Figura 2: Microscopía de fluorescencia de una sola molécula. (A) Representación esquemática del ensayo de extensión del cebador de una sola molécula utilizando levadura Pol δ marcada con AF647. (B) Campo de visión típico obtenido a partir de un ensayo de una sola molécula. Cada mancha representa una δ Pol marcada con fluorescencia que se une a una plantilla de ADN. Barra de escala: 10 μm. (C) (Arriba) Molécula de ejemplo del ensayo de una sola molécula que muestra la unión on/off a medida que se intercambia el δ Pol. (Abajo) Trayectoria de una sola molécula de la misma molécula que muestra la intensidad a lo largo del tiempo del experimento. La línea negra representa el ajuste del modelo de Markov oculto (HMM) a los datos. (D) Tiempo de permanencia de Pol δ en el sustrato G4 (púrpura) y el sustrato control (gris). Las líneas representan ajustes exponenciales, lo que proporciona una vida útil de 6 s ± 2 s en el sustrato G4 y de 10 s ± 3 s en el sustrato de control. (E) Número de eventos de unión de Pol δ a sustratos individuales de ADN. La mediana del número de eventos de unión en el sustrato G4 (púrpura) es 3,5, en comparación con el sustrato de control 1 (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Espectroscopía CD. Espectros CD de la secuencia de formación de G4 (púrpura) y de control (gris) en un tampón TE que contiene 200 mM de KCl a 25 °C. El pico característico a 260 nm, seguido por el pico negativo a 240 nm, es característico de un GQ intramolecular paralelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Construcción de la celda de flujo. (A) Esquema de las piezas individuales de la celda de flujo. El bloque cuadrado de PDMS se coloca en la parte superior del cubreobjetos del microscopio. A continuación, estas piezas se encajan dentro de la tapa y la parte inferior del soporte de la celda de flujo. (B) La celda de flujo completa. Se pueden insertar tubos en cada lado del bloque PDMS para formar los canales a través de los cuales los tampones pueden fluir a través del dispositivo a través de la microfluídica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Trayectorias de una sola molécula. (A) Ejemplo de trayectoria de una molécula que experimenta un solo evento de unión durante el período de tiempo de 10 minutos del experimento. (B) Ejemplo de trayectoria de una molécula que experimenta eventos de unión a cero durante el período de tiempo de 10 minutos del experimento. La línea negra en (A) y (B) representa el ajuste del modelo de Markov oculto (HMM) a los datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Tiempos de permanencia. (A) Tiempo de permanencia de Pol δ en el sustrato G4. La línea representa el ajuste exponencial, dando un tiempo de vida de 6 s ± 2 s. (B) Tiempo de permanencia de Pol δ en el sustrato de control. El ajuste exponencial proporciona una vida útil de 10 s ± 3 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 5: Control del fotoblanqueo. El gráfico muestra el tiempo medio que tarda una enzima Pol δ de levadura individual marcada con AF647 en ser fotoblanqueada por el láser de 647 nm. La línea representa el ajuste exponencial, dando una vida útil de 39 ± 6 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

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