Name: En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio con dos fotones en vivo en la corteza cerebral de ratones. Este método permite registrar la actividad de poblaciones neuronales densas con resolución de célula única para estudiar la dinámica de microcircuitos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Queremos agradecer a Olga Garaschuk útil para los debates sobre la optimización de la carga masiva de los indicadores de calcio.

<ol><li> Prepare la solución de calcio indicador fluorescente. Usamos tintes acetoximetil éster, o AM tintes para el cortocircuito. Estos son los tintes que pueden ser absorbidos por las células cuando se inyecta extracelular. Por lo general el uso de Oregon-Green BAPTA-1 AM o Fluo-4 AM a una concentración de 1 mM. Colorantes AM se puede obtener de Invitrogen en viales de 50 microgramos. En primer lugar, preparar una solución al 20% de Pluronic F-127 en DMSO. Calentamos la solución antes de usar todos los días hasta su claro. Disolvemos el indicador de calcio F-127/DMSO Pluronic 20% durante 15-20 minutos a una concentración de 10 mM. A continuación, se diluye la solución a 1 mM en una solución que contiene, en mm: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPES, pH 7,4. Además, el 100 sulforodamina M 101 es por lo general incluyen a los astrocitos etiqueta y visualizar la pipeta durante la inyección. Vamos a filtrar la solución antes de la inyección con un filtro de 0,49 micras centrífuga (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006). </li><li> Implantar una ventana craneal en el área a explorar. Hemos <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">descrito el enfoque general en JoVe</a> , pero las siguientes modificaciones son importantes para la inyección de calcio tinte: Hacer una craneotomía menor de 2 mm de diámetro sobre el área cortical de interés, teniendo cuidado de no dañar la base dura. Asegurar un cubreobjetos en su lugar sobre la craneotomía, sino únicamente una parte de la craneotomía, dejando un pequeño espacio entre el borde de la craneotomía y el cubreobjetos para dejar espacio para una pipeta para entrar en la corteza oblicuamente. Antes de la inyección, hacer un pozo poco profundo con cemento dental alrededor de la craneotomía. El pozo debe extenderse en dirección rostral y ser lo suficientemente poco profundo para permitir la inserción de la micropipeta para inyección. </li><li> Transferir el ratón transferidos a la platina del microscopio e inmovilizar la cabeza, como se muestra en la <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">imagen de vídeo en el flujo sanguíneo</a> . </li><li> Tire de pipetas de vidrio de microelectrodos a un diámetro de la punta produciendo 4.2 Mega ohmios de la resistencia, usando un extractor de la pipeta. Cargar el indicador de calcio mezcla tinta en los pipeta de vidrio con una microjeringa. El uso de un micromanipulador, baje suavemente la micropipeta en la superficie del cerebro utilizando un objetivo de 4X, que luego es finamente colocados bajo un objetivo de 40X. Seleccione una ubicación adecuada para la inyección, de modo que hay que recubre los vasos pocas o ninguna sangre para ocultar la imagen. Utilizando microscopía de dos fotones, la punta de la pipeta se visualiza y avanzaba lentamente en la corteza, a una profundidad de 200 micrómetros por debajo de la duramadre. Entonces, la presión se inyecta la mezcla de tinte a 10 psi por 1 minuto con un Picospritzer. Por lo general, la entrega de dos a cuatro inyecciones de la mezcla de tinte AM calcio, separados en el espacio de aproximadamente 200 a 300 micrones. Este enfoque de carga a granel de las inyecciones de un poco por encima se asegura de que un área tan grande como 600 x 600 micrones es adecuada para el teñido de imágenes de calcio. Comenzará a marcar una hora después de la inyección de la mezcla de tinte AM, para permitir el tinte para difundir y ser tomado por las neuronas. </li><li> Realizar en vivo de dos fotones de imágenes con un microscopio por encargo de dos fotones usando un camaleón Ti-zafiro láser (en sintonía con 800-880 nm) y Cambridge Technology espejos galvanómetro. Adquirimos las imágenes utilizando el software scanimage desarrollado en el laboratorio de Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Potencia del láser es normalmente muy por debajo de 70 mW en la muestra. Imágenes de todo el campo se adquieren mediante un 20X (0,95 NA) o 40x (0,8 NA) los objetivos de Olympus, a 1,95 a 15,63 fotogramas por segundo (512 x 256 píxeles a 256 x 64 píxeles). Líneas de barrido se adquieren a 500 Hz. Durante estas pruebas, los animales se mantienen bajo ligera anestesia con isoflurano (0.6-0.9%), y también se mantienen a 37 ° C usando un aparato de Harvard temperatura del dispositivo de control. Hay que tener cuidado para mantener el ritmo respiratorio de los animales, cerca de 100 respiraciones / minuto posible. Este nivel de uso de anestesia es el nivel más bajo que inmoviliza al animal, pero sigue permitiendo la actividad espontánea que se grabará. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

La ventaja de este método sobre los registros electrofisiológicos es que es menos invasiva y permite que las grabaciones de la actividad en las densas redes neuronales neuronal. Al hacer este procedimiento s importante recordar que tener sumo cuidado al realizar la craneotomía para no dañar la duramadre. Incluso una pequeña cantidad de sangrado subdural con mucho oscurecer la imagen.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforodamina 101</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Plurónico F-127 en DMSO</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrífugo (0,45 micrones)</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo 2-photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución. El método consiste en la implantación de una ventana de imagen del cráneo, se inyecta una solución de calcio indicador fluorescente que puede ser ocupado por un gran número de neuronas y, por último registro de la actividad de las neuronas con las imágenes de calcio lapso de tiempo con una in-vivo dos microscopio de fotones. Co-inyección de astrocito específicos colorantes permite diferenciar las neuronas de los astrocitos. La técnica puede llevarse a cabo en ratones que expresan moléculas fluorescentes en subpoblaciones específicas de neuronas para entender mejor las interacciones en la red de los diferentes grupos de células.

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Para comprender la dinámica de red de los microcircuitos en la neocorteza, es esencial registrar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas . ...

Para comprender la dinámica de redes de microcircuitos en la neocorteza, es esencial registrar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. In vivo. La imagen de calcio es el único método que permite registrar la actividad de una población densa de neuronas con resolución a nivel celular individual.El método consiste en implantar una ventana de imagen craneal e inyectar un colorante fluorescente de calcio que puede ser captado por un gran número de neuronas, y finalmente registrar la actividad neuronal mediante imágenes de calcio con intervalos de tiempo. Hola, soy Payman Go del laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Escuela de Medicina David Geffen en UCLA. En videos anteriores, nuestro laboratorio demostró un procedimiento para realizar craneotomía e imágenes de fotones para el flujo sanguíneo en ratones.Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar imágenes de calcio con fotones in vivo en ratones. Así que comencemos. Antes de iniciar, se debe preparar la solución de inyección del colorante.Primero, prepare la solución indicadora de calcio fluorescente. Utilizamos colorantes éster etílico o colorantes AM, abreviadamente. Esto

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

Presentamos un en vivo imagen de protocolo de la corteza cerebral de ratones neonatales de la proyección de imagen de dos fotones. Este método es adecuado para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, los mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y los cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

El presente protocolo describe la fabricación de una ventana craneal grande (6 x 3 mm2) utilizando envoltura de alimentos, silicona transparente y vidrio de cubierta. Esta ventana craneal permite experimentos in vivo de imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones en el mismo ratón.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

Aprende a realizar imágenes de calcio con dos fotones en vivo en la corteza cerebral de ratones. Este método permite registrar la actividad de poblaciones neuronales densas con resolución de célula única para estudiar la dinámica de microcircuitos.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Explorar más videos