En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Para comprender la dinámica de redes de microcircuitos en el neocórtex, es esencial registrar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. In vivo. Las imágenes de calcio son el único método que permite registrar la actividad de una población neuronal densa con resolución de una sola célula.

El método consiste en implantar una ventana de imagen craneal inyectando un tinte de calcio fluorescente que puede ser absorbido por un gran número de neuronas y, finalmente, registrar la actividad de las neuronas con imágenes de calcio de lapso de tiempo. Hola, soy Payman y vengo del laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Facultad de Medicina David Geffen de la UCLA. En videos anteriores, nuestro laboratorio demostró un procedimiento para realizar craneotomías e imágenes fotónicas del flujo sanguíneo en ratones.

Hoy te mostraremos un procedimiento para realizar imágenes de calcio in vivo a fotones en ratones. Así que vamos a ello antes de empezar. Se debe preparar la solución de inyección de tinte.

Primero, prepare la solución indicadora de calcio fluorescente. Utilizamos tintes de éster etílico o tintes am para abreviar. Estos son tintes que pueden ser absorbidos por las células cuando se inyectan extracelularmente, por lo general usamos BAFTA verde de órgano 1:00 AM o gripe oh 4:00 AM a una concentración de un milimolar.

Primero preparamos una solución al 20% de onic F1 27. En DMSO, calentamos la solución antes de usarla todos los días hasta que esté clara. Disolvemos el indicador de calcio en 20%onic F1 27 DMSO durante 15 a 20 minutos hasta una concentración de 10 milimolares.

A continuación, diluimos la solución a un milimolar en la solución que contiene en milimolar un 50 y ACL 2,5 KCL 10 montones, pH 7,4 y vórtice durante 10 a 20 minutos adicionales. Añadimos 100 micromolares de azufre rumino 1 0 1 para marcar selectivamente los astrocitos y visualizar la pipeta durante la inyección del colorante, a continuación implantamos una ventana craneal sobre la zona a fotografiar. El enfoque general de esta cirugía es descrito por nosotros en un artículo de video de trabajo publicado anteriormente, pero las siguientes modificaciones son importantes para la inyección de tinte de calcio.

Se realiza una craneotomía más pequeña de dos milímetros de diámetro sobre el área cortical de interés, teniendo mucho cuidado de no dañar la duramadre subyacente. Se asegura un cubreobjetos sobre la craneotomía, pero solo parcialmente cubriendo la craneotomía, dejando un pequeño espacio entre el borde de la craneotomía y el cubreobjetos de vidrio para dejar espacio para que una pipeta ingrese a la corteza oblicuamente antes de la inyección. Se hace un pozo poco profundo con cemento dental alrededor de la craneotomía.

El pocillo para los experimentos de imágenes de calcio debe extenderse lo más posible en la dirección rostral y ser lo suficientemente poco profundo como para permitir la introducción de la micropipeta de inyección, filtramos la solución con un filtro centrífugo de 0,45 micras inmediatamente antes de la inyección. A continuación, se transfiere el ratón a la platina del microscopio y se inmoviliza la cabeza, como se muestra en nuestro vídeo sobre imágenes de flujo sanguíneo. A continuación, tiramos de pipetas de microelectrodos de vidrio hasta un diámetro de punta que produce de dos a cuatro mega ohmios de resistencia.

Con un extractor de pipetas, la mezcla de colorante indicador de calcio se carga en la pipeta de vidrio. Usando una micro jeringa con un micro manipulador, la micropipeta se baja suavemente sobre la superficie del cerebro usando un objetivo de cuatro x y luego se coloca más finamente. Con un objetivo de 40x, se elige un lugar adecuado para la inyección de manera que haya pocos o ningún vaso sanguíneo suprayacente.

Para oscurecer la imagen utilizando microscopía de dos fotones, se visualiza la punta de la micropipeta y se avanza lentamente hacia la corteza hasta una profundidad de 200 micrómetros por debajo de la duramadre. Para realizar esto con la mayor precisión posible, la lectura de enfoque Z del objetivo se establece en cero. Una vez que se visualiza la duramadre, se visualiza la micropipeta y se toma la lectura del enfoque Z a medida que la micropipeta se baja en el cerebro a 200 micrómetros por debajo de la duramadre.

A continuación, la mezcla D se inyecta a presión a 10 PSI durante un minuto. Usando un pico spritzer, generalmente administramos de dos a cuatro inyecciones de la mezcla de colorante de calcio AM separadas en el espacio por aproximadamente 200 a 300 micras. Este enfoque de carga masiva de inyecciones ligeramente superpuestas garantiza que un área tan grande como 600 por 600 micras se tiña adecuadamente para obtener imágenes de calcio.

Las imágenes comienzan una hora después de la inyección de la mezcla de colorante am para permitir que el tinte se difunda y sea absorbido por las neuronas. Las imágenes in vivo de dos fotones se realizan con un microscopio de dos fotones hecho a medida utilizando un láser de zafiro camaleónico ajustado a 800 a 880 nanómetros y tecnología Cambridge. Las imágenes de los espejos del galvanómetro se adquieren utilizando el software de escaneo de imágenes desarrollado en Carl's Vida's.

La potencia del láser de laboratorio suele estar muy por debajo de los 70 milivatios en la muestra. Las imágenes de campo completo se adquieren utilizando un objetivo Olympus de 20 x 0,95 NA a 1,95 a 15,63 fotogramas por segundo, cinco de 12 por 2 56 píxeles a 2 56 por 64 píxeles. Los escaneos lineales se adquieren a 500 hercios durante la obtención de imágenes.

Los animales se mantienen bajo luz de flúor, anestesia de 0,6 a 0,9% y también se mantienen a 37 grados centígrados utilizando un aparato de Harvard. El dispositivo de control de temperatura tiene cuidado de mantener la frecuencia respiratoria de los animales lo más cerca posible de 100 respiraciones por minuto. Este nivel de uso de anestesia es el nivel más bajo que inmoviliza al animal, pero aún así permite registrar la actividad espontánea.

Así que ahora echemos un vistazo a un experimento típico de imágenes de calcio. Hay dos tres neuronas de la corteza de barril somatosensorial de un ratón postnatal a ocho 10. Se tiñeron con BTA am verde órgano y se tomaron imágenes con un objetivo de 20 x 0,95 NA.

Las imágenes se tomaron cada 0,512 segundos. Esta película de tres minutos muestra la coactivación de grandes proporciones de las neuronas de esta tinción que ocurre una o dos veces por minuto. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes de calcio in vivo de la actividad de la red en la capa dos tres de la corteza cerebral.

La ventaja de este método sobre los registros electrofisiológicos es que es menos invasivo y permite el registro de la actividad en redes neuronales densas. Al realizar este procedimiento. Es importante recordar tener mucho cuidado al realizar la craneotomía para no dañar la duramadre.

Incluso una pequeña cantidad de sangrado subdural oscurecerá en gran medida las imágenes. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.