Preparación mitocondrial de la microglía para el análisis de glicanos

En términos generales, nuestra investigación se centra en determinar el papel mecanicista de los azúcares o glicanos, y cómo podemos aprovechar esas vías de glicosilación celular y subcelular en el envejecimiento, así como en los trastornos cerebrales. Actualmente, existe una brecha en el conocimiento sobre el papel y la modulación de los glicanos subcelulares en diferentes fisiopatologías de enfermedades, incluidos los trastornos cerebrales agudos y crónicos como el accidente cerebrovascular y el Alzheimer. Este protocolo y nuestra investigación tienen como objetivo avanzar en el conocimiento sobre el papel de los glicanos en las interacciones neuroinmunes y cómo se puede aprovechar esa información para diseñar terapias mejores y más eficientes para el sistema nervioso central.

[Narrador] Para comenzar, obtenga células microgliales BV-2 derivadas de ratones C57BL / 6. Manténgalos en medio DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales. Cultive las células en matraces T175 hasta que alcancen una confluencia del 70 al 80%. Aspira los medios del matraz. Vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de medio de crecimiento. Usando azul de tripano, cuente las celdas. Centrifugar las células en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros a 500 G durante cinco minutos. Aspira y desecha con cuidado el sobrenadante. Agregue 800 microlitros de reactivo de aislamiento mitocondrial A y vórtice a velocidad media durante cinco segundos. Luego incube el tubo en hielo durante exactamente dos minutos. Agregue 10 microlitros de reactivo de aislamiento mitocondrial B y vórtice a máxima velocidad durante cinco segundos. Incubar en hielo durante cinco minutos, agitando en vórtice a máxima velocidad cada minuto. Ahora agregue 800 microlitros de reactivo de aislamiento mitocondrial C e invierta el tubo para mezclar. Y centrifugar a 700 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros y centrifugue a 3.000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante que contiene la porción citosólica a un nuevo tubo. El gránulo contiene las mitocondrias aisladas. Agregue 500 microlitros de reactivo C de aislamiento mitocondrial al gránulo y centrifugue a 12,000 G durante cinco minutos. Resuspender las mitocondrias aisladas en 50 microlitros de tampón de aislamiento de proteínas. Deje la suspensión en hielo durante 20 minutos. Aspirar y dispensar tres veces, y dejar en hielo durante 20 minutos, agitando en vórtice antes de usar. Si no está completamente solubilizado, agregue otros 50 microlitros de tampón y acumule en el mismo tubo. Centrifugar a 13.000 G durante 10 minutos. Después de recuperar y congelar el sobrenadante, secar con un concentrador de vacío. Para la detección de glicanos liberados, vuelva a suspender los glicanos secos y unidos en 50 microlitros de agua de grado LCMS. Pipetee cinco microlitros de glicanos mitocondriales resuspendidos en un punto de muestra en un portaobjetos de micropocillos de teflón. Ionizar y detectar N-glicanos en modo de ionización negativa utilizando un disolvente electrospray compuesto por un 60% de acetonitrilo y un milimolar de ácido acético a un caudal de dos microlitros por minuto y una tensión de 3,2 kilovoltios. Acople IR-MALDESI a un espectrómetro de masas HRAM establecido en una potencia de resolución de 240.000 ancho total a la mitad del máximo en una relación masa-carga de 200 para analizar entre 502.000 relaciones masa-carga en modo de ionización negativa. Identifique manualmente los glicanos ligados a N buscando masas monoisotópicas. Confirme las distribuciones isotópicas utilizando el espaciado masa-carga para determinar iones doblemente cargados y triplicados con un umbral mínimo de flujo de iones de 1.000 iones por segundo. Convierta los espectros de masas sin procesar para relaciones masa-carga en masas monoisotópicas neutras. Luego, cargue las masas monoisotópicas en una herramienta de predicción de estructura de oligosacáridos en línea para determinar las posibles composiciones de glicanos. Confirme las anotaciones utilizando una base de datos de glicos seleccionada experimentalmente. Asegúrese de que cada identificación esté dentro del margen de precisión de medición de masa de 2,5 partes por millón, contenga el núcleo y la estructura de glicanos vinculados, y excluya la pentosa, el ácido 3-desoxi-d-mano-oct-2-ulosónico o los monosacáridos de ácido urónico. Las concentraciones de proteínas mitocondriales obtenidas de seis preparaciones independientes no mostraron variaciones significativas, lo que confirma una alta reproducibilidad. El análisis de sangre occidental mostró expresión de CoxIV solo en las fracciones mitocondriales y GAPDH solo en fracciones citoplasmáticas, confirmando la pureza de los aislamientos mitocondriales y la ausencia de contaminación no mitocondrial. Se detectaron distintas estructuras de N-glicano sialilado, fosforilado y sulfatado en extractos mitocondriales utilizando IR-MALDESI. Los valores cuadráticos altos que prueban una bondad de ajuste confirmaron la detección de glicanos ligados a N con uno y dos aductos de cloro, confirmando la detección de estas composiciones de glicanos utilizando IR-MALDESI.