Citometría de fosfoflujo intracelular de xenotrasplantes derivados de pacientes con leucemia mieloide aguda

Nuestra investigación tiene como objetivo comprender cómo la leucemia mieloide aguda desarrolla resistencia a las terapias aprobadas. Basado en la hipótesis de que el metabolismo juega un papel clave. El objetivo final es identificar estrategias que puedan superar eficazmente esta resistencia. La citometría de flujo, ampliamente utilizada en la investigación de la leucemia, es ideal para analizar células en suspensión como las células leucémicas. Su adaptabilidad lo convierte en una poderosa herramienta para el mecanismo molecular de datos. El principal desafío experimental en la investigación de la LMA es desarrollar un protocolo in vivo óptimo para la reactivación molecular, que es célula para modelar con precisión, comprender el mecanismo subyacente a la resistencia terapéutica.

[Narrador] Para comenzar, dobla la rodilla del ratón y usa la mano no dominante para inmovilizar la pierna con el fin de exponer la superficie articular del fémur donde se encuentra el lado de punción. Coloque el pulgar en la tibia, el dedo índice en el fémur y el dedo medio en el lado externo de los huesos para estabilizarlos. Mientras mantiene la inmovilización, desinfecte el área de la rodilla con alcohol isopropílico para apartar los pelos restantes y mejorar la visualización de la estructura ósea. Con la primera jeringa seca de calibre 25, coloque la aguja en el medio de la articulación del fémur y gírela suavemente para crear un orificio en la superficie articular femoral sin aplicar fuerza. Una vez que la aguja entre en la médula, retire gradualmente la jeringa mientras la gira. Inserte la segunda jeringa enjuagada en el orificio creado por la primera aguja. Aplique vacío a la segunda jeringa insertada en el fémur mientras la gira suavemente y la retira gradualmente. Transfiera la médula ósea extraída enjuagando el contenido de la jeringa en un tubo de microcentrífuga refrigerado que contenga 500 microlitros de PBS. Mantenga la muestra en hielo. Aplique una presión suave en el sitio de la punción con un hisopo de isopropanol durante 30 segundos para detener cualquier sangrado. Centrifugar las células a 500G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Usando un sistema de aspiración al vacío, aspire suavemente y deseche el sobrenadante. Agregue 200 microlitros por muestra de solución de tinción de células fluorescentes. Diluido de uno a 100 en PBS para etiquetar las células muertas. Vuelva a suspender suavemente las células con una pipeta. Luego incube las células en hielo durante 10 minutos, protegidas de la luz. Después de 10 minutos, centrifugar las células a 500G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspire y deseche el sobrenadante usando un sistema de vacío, agregue 100 microlitros por muestra de anticuerpo HCD 45 Brilliant ultraviolet 395 diluido de uno a 100 en PBS que contiene 2% de suero fetal bovino para marcar células hematopoyéticas humanas. Incube las células en hielo durante 15 minutos, asegurándose de que estén protegidas de la luz. Centrifugar las células a 500G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante utilizando un sistema de vacío. Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de formaldehído al 1,6% en solución de PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, protegido de la luz. Después de 10 minutos, centrifugar las células a 500G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante utilizando un sistema de vacío. Ahora agregue un mililitro de metanol al 100%, preenfriado a menos 20 grados centígrados directamente en los dos. Incube las muestras a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos protegidas de la luz. Centrifugar las células a 500G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Usando un sistema de vacío, aspire y deseche el sobrenadante. Agregue 50 microlitros de solución mixta de anticuerpos o solución mixta de control de isotipo a cada muestra. Vuelva a suspender suavemente las células con una pipeta, incube todas las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados, asegurándose de que estén protegidas de la luz. A continuación, centrifugar las células a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, lave las células con 1000 microlitros de PBS volviéndolas a suspender suavemente con una pipeta. Centrifugar las células nuevamente a 500G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, realice un segundo lavado con 1000 microlitros de PBS y vuelva a suspender suavemente las células con una pipeta antes de centrifugar las células nuevamente a cuatro grados centígrados. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender las muestras finales en 200 microlitros de PBS. Esta figura ilustra el flujo de trabajo, la estrategia de activación y la normalización de las señales de fosfoproteína intracelular en células de médula ósea de ratones xenoinjertos derivados de pacientes con leucemia mieloide aguda tratados con terapia basada en venetoclax durante 15 días. La estrategia de activación identificó con éxito células viables de leucemia mieloide aguda humana o LMA en función de los perfiles de dispersión directa y lateral y la positividad de CD45, lo que permitió un análisis coherente en todos los grupos de tratamiento. El tratamiento con venetoclax 5-azacitidina y uridina CDZ condujo a un aumento de la fosforilación de STAT5 y RPS6 en las células de LMA, lo que sugiere la activación de las vías de supervivencia asociadas con la resistencia. Curiosamente, cuando los ratones fueron tratados con Gilteritinib, el tratamiento no redujo significativamente la fosforilación de las proteínas de la vía FLT3, lo que indica que la señalización persistió a pesar de la terapia dirigida. STAT5 fosforilado y RPS6 fosforilado mostraron el mayor aumento en la correlación en los niveles de expresión después de la terapia basada en venetoclax, lo que indica la coactivación de estas vías.