Name: In vitro Cultivo de linfocitos T de pato específicos para H5N1 y detección de respuestas inmunitarias mediante el método de tinción de citocinas intracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a cultivar linfocitos T específicos para H5N1 en patos y detectar IFN-γ mediante tinción intracelular de citocinas. Este protocolo permite estudiar la inmunidad aviar y desarrollar herramientas para vacunas.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos de centrífuga</td><td>Biosharp</td><td>Cat#BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos (sin tratar, fondo plano)</td><td>Biofil</td><td>Cat#TCP000048</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de qPCR sin faldón de 96 pocillos</td><td>Labselect</td><td>Cat#PP-96-NS-0100</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm kit</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#BD 554714</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#347688</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular Incubadora de CO2 Thermo</td><td>Fisher</td><td>Heracell 150i GP</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Kit de etiquetado Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Abcam</td><td>Cat#ab113853</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Cat#Q341-02</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de linfocitos de sangre periférica de pato</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#LTS1090D</td><td></td></tr><tr><td>Evo M-MLV RT Premix</td><td>Accurate Biotechnology</td><td>Cat#AG11706</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Aislamiento total de ARN de células/tejidos Kit V2</td><td>Vazyme</td><td>Cat#RC112-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>Cat#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td>BA43347</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de flujo</td><td>Beyotime</td><td>Cat#FFC005</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>Tree Star</td><td>https://www.flowjo.com</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse 488, dilución 1:50</td><td>Abbkine</td><td>Cat#A23210</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón de Cabra IgG2b, FITC, dilución 1:50</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat#1091-31</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón de Cabra IgG3, PE, dilución 1:250</td><td>Southern Biotech&nbsp;</td><td>Cat#1100-09S</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad prisma 8.0.2</td><td>Software GraphPad</td><td>https://www.graphpad-prism.cn</td><td></td></tr><tr><td>H5N1 AIV cepa DK383</td><td>Laboratorio Nacional y Regional de Ingeniería Conjunta para la Prevención y Control de Zoonosis Medicamen A</td><td>/Duck/Guangdong/383/2008</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Motic</td><td>AE2000</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Pato CD4, dilución 1:50</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#MCA2478</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Pato CD8&alfa;, dilución 1:50</td><td>GeneTex&nbsp;</td><td>Cat#GTX41834</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Duck IFN-&gamma; mAb, dilución 1:10</td><td>Preparado en nuestro laboratorio&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NA NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>AZY1603209</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (no esencial</td><td>Gibco</td><td>Cat#11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>Cat#10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Biometra</td><td>Biometra Tone 96G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7500</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante (10 &mu; g)</td> <td>USCNK</td><td>Cat # RPA111Ga01</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Tbdscience</td><td>Cat # NH4CL2009</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat # 11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td> <td>Gibco</td><td>Cat # 11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # 93595</td><td></td></tr><tr><td>Patos reales de dos semanas (Sheldrake)</td> <td>una granja de patos en Guangzhou</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro cultivo de linfocitos t de pato específicos para h5n1 y detección de respuestas inmunitarias mediante el método de tinción de citocinas intracelulares

In Vitro Culture for H5N1-Specific Duck T Cells and Detection of Immune Responses Using Intracellular Cytokine Staining Method

Este protocolo se desarrolló en base a un estudio previo sobre la detección de respuestas efectoras de células T específicas de antígeno en patos20. El primer paso del experimento consiste en el cultivo in vitro de células T específicas del virus, que sirven de base para posteriores estudios de respuesta a efectores. Inicialmente, las APC se incubaron y se cocultivaron con células efectoras. Las observaciones morfológicas revelaron que después de la proliferación, las células exhibieron c...

In vitro Cultivo de linfocitos T de pato específicos para H5N1 y detección de respuestas inmunitarias mediante el método de tinción de citocinas intracelulares

The in vitro culture of T cells is a critical method for studying immune responses, viral infections, and potential therapeutic strategies. However, no ...

in-vitro-culture-for-h5n1-specific-duck-t-cells-detection-immune

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

A diferencia del VIH-1 partículas libres de células, las células T CD4 + infectados son detectados con eficacia por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). Este manuscrito describe un método donde las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o PDC aisladas son co-cultivadas con VIH-1 en las células T infectadas para evaluar detección innata por PDC según la evaluación de liberación de IFN de tipo I.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

La capacidad de controlar las respuestas de células T en detalle en vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune. Aquí se describe el uso de conjuntos de blancos fluorescentes (TLC) en un ensayo in vivo de células T en el que evalúa&gt; 250 parámetros simultáneamente por citometría de flujo.

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

Se utilizaron dos métodos basados en citometría de flujo: un ensayo de cebado de células T in vitro y una tinción de citocinas intracelulares para medir la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas y las respuestas de las células T específicas de antígeno a una infección mutante por el virus del Nilo Occidental en ratones.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

El desarrollo de la prueba de interferón-gamma ELISpot para conejillo de Indias PBMCs permite la caracterización de las respuestas de células T en este modelo altamente relevante para el estudio de las enfermedades infecciosas. Hemos aplicado el ensayo para medir las respuestas de células T asociadas con entrega intradérmica de vacunas de ADN.

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.

Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.

Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios

Aquí describimos un protocolo para el empaquetado de pseudovirus y la medición de la actividad neutralizante de anticuerpos.

Preparación de virus de la influenza aviar H5 pseudotipificados con el método de transfección de fosfato de calcio y medición de la actividad neutralizante de anticuerpos

Aprende a cultivar linfocitos T específicos para H5N1 en patos y detectar IFN-γ mediante tinción intracelular de citocinas. Este protocolo permite estudiar la inmunidad aviar y desarrollar herramientas para vacunas.

In vitro Cultivo de linfocitos T de pato específicos para H5N1 y detección de respuestas inmunitarias mediante el método de tinción de citocinas intracelulares (Video) | JoVE Journal

In vitro Cultivo de linfocitos T de pato específicos para H5N1 y detección de respuestas inmunitarias mediante el método de tinción de citocinas intracelulares

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