Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica con fibrosis
18 de julio de 2025
Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD) con disfunción metabólica, cambios en la expresión génica hepática y alteraciones histopatológicas hepáticas que se asemejan a la MASLD humana, incluida la fibrosis que progresa a la fase 3 de fibrosis avanzada. Este modelo se puede utilizar en estudios de fisiopatología de MASLD y en estudios preclínicos de nuevas terapias.
En nuestra investigación, nos centramos en la enfermedad hepática estetótica asociada a disfunción metabólica, o MASLD, y específicamente en los mecanismos de acumulación de lípidos y fibrosis. Algunos de los desarrollos recientes son la transcriptómica unicelular y la transcriptómica especial, la estandarización de modelos animales de MASLD y la aprobación de semaglutida para el tratamiento de MASLD. Existen muchos modelos animales de MASLD, pero descubrimos que muchos no inducían fibrosis hepática.
Así que, para abordar ese punto, desarrollamos nuestro modelo ratón de MASLD. Nuestro modelo murino induce la MASLD con fibrosis al alimentar a ratones hiperfágicos con una dieta similar a la dieta media estadounidense. Esto causa MASLD muy similar a la enfermedad en humanos.
Nuestro método facilitará estudios sobre la fisiopatología de la MASLD y la prueba de nuevas terapias. Para empezar, obtén una sección de tejido hepático incrustada en parafina en una lámina. Para la desparafinización, sumerge la lámina en xileno o citrisolv durante cinco a quince minutos.
Luego rehidrata la sección en serie con etanol 100, 95 y 70%, seguida de agua destilada durante cinco minutos en cada una. Luego tiñe la sección con Sirius Red y deshidrata el portaobjetos. Retira una lámina a la vez de la solución limpiadora y ponla con papel de cocina para eliminar el exceso de líquido.
Añade aproximadamente entre 50 y 100 microlitros de medio de montaje a la sección. Cubre la sección con un engobe de cubierta y presiónala suavemente para eliminar las burbujas de aire. Deja que el portaobjetos se seque al aire.
Ahora, observa la sección preparada bajo un microscopio óptico con iluminación en campo brillante usando objetivos de 4x a 20x. Transfiere aproximadamente entre 500 y 1000 microlitros de homogeneado hepático a tubos centrífugos de 1,5 mililitros y añade ácido tricloroacético para alcanzar una concentración final del 12%. Vórtice brevemente el tubo para mezclar el contenido. Incuba el tubo en un baño de agua con hielo durante 30 minutos y centrívalo a 6.000 g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Luego retira el sobrenadante con una pipeta. Añade un mililitro de etanol 100% frío para lavar el pellet y sonicarlo para que se resuspenda bien. Después de centrifugar la suspensión de nuevo, aspira el sobrenadante.
Tras el tercer lavado, mantén el tubo abierto para que seque el pellet al aire durante 10 minutos o más según sea necesario. Luego añade 800 microlitros de 6 ácidos clorhídricos normales al tubo que contiene la boluleta de proteína, y resuspende la pastilla usando un sonador, como se ha demostrado antes. Transfiere la suspensión a un tubo de vidrio o vial con tapón de rosca y sella herméticamente la tapa.
Incuba el tubo en un horno a 110 grados Celsius durante unas 22 horas. Si es necesario, transfiere el contenido del vial de vidrio a un tubo de centrifugadora antes de centrifugarlo. Centrifugar la muestra hidrolizada a 16.000 g durante 10 minutos y aspirar el sobrenadante que contiene hidroxiprolina en un tubo de 1,5 mililitros.
Para la oxidación de hidroxiprolina, añadir 450 microlitros de solución de cloramina a tubos con 50 microlitros de muestra y estándares. Mezcla el contenido de los tubos con un vórtice e incuba a temperatura ambiente durante 25 minutos. Luego añade 500 microlitros del reactivo de Ehrlich a cada muestra y estándar.
Después del vórtice, incuba las muestras a 65 grados Celsius durante 20 minutos en una incubadora. Tras la incubación, deja que los tubos se enfríen hasta temperatura ambiente y observa el color final de las muestras. Finalmente, mide la absorbancia de muestras y estándares usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 550 nanómetros.
La tinción de colágeno del tejido hepático con Rojo Picro Sirius, observada con iluminación de campo brillante, mostró rojo colágeno con fondo naranja claro o amarillo. Se tintó la deposición de colágeno correspondiente a fibrosis, así como el colágeno en las paredes de los vasos sanguíneos, el hilo y la cápsula hepática. La microscopía de luz polarizada reveló fibras de colágeno birrefringentes distintas sobre un fondo oscuro, mejorando la visualización de la fibrosis.
La cuantificación del área positiva de colágeno hepático en ratones amarillos de agutí alimentados con dieta alta en grasas y fructosa, o HFFD, mostró una fibrosis significativamente mayor en comparación con ratones control salvajes alimentados con dieta baja en grasa y fructosa. La cuantificación del contenido hepático de hidroxiprolina reveló un nivel significativamente mayor en ratones amarillos de agutí alimentados con dieta HFFD en comparación con los ratones control tras 16 semanas de dieta, confirmando un aumento en la deposición de colágeno en hígados fibróticos.
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Descripción general
Este estudio presenta un modelo murino de enfermedad hepática esteatósica asociada a disfunción metabólica (MASLD) que imita de cerca la MASLD humana, incluida la progresión hacia fibrosis avanzada. El modelo es fundamental para investigar la fisiopatología de la MASLD y probar nuevos enfoques terapéuticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Disfunción metabólica
- Enfermedad hepática
- Modelos animales
Antecedentes
- La DAME se caracteriza por la acumulación de lípidos y fibrosis en el hígado.
- Los modelos animales existentes a menudo no logran inducir fibrosis hepática.
- Los avances recientes incluyen la transcriptómica de célula individual y espacial.
- El semaglutido ha sido aprobado para el tratamiento de la DAME.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo fiable de ratón de la enfermedad por hígado graso asociada al metabolismo (MASLD) que induzca fibrosis.
- Estudiar los mecanismos subyacentes a la acumulación de lípidos y la fibrosis.
- Facilitar estudios preclínicos de terapias potenciales para la enfermedad por hígado graso asociada al metabolismo (MASLD).
Métodos Utilizados
- Alimentar a ratones hiperfágicos con una dieta similar a la dieta promedio estadounidense.
- Monitorear los cambios en la expresión génica hepática.
- Evaluar las alteraciones histopatológicas del hígado.
- Valorar la progresión de las etapas de fibrosis.
Resultados principales
- El modelo murino indujo con éxito la DMASH con fibrosis.
- Los cambios histopatológicos fueron similares a los observados en la DMASH humana.
- La fibrosis progresó hasta la etapa avanzada 3.
- Este modelo puede utilizarse para investigaciones futuras sobre terapias para la DMASH.
Conclusiones
- El modelo de ratón desarrollado es una herramienta valiosa para estudiar la DMHG.
- Proporciona información sobre la fisiopatología de la enfermedad.
- Este modelo puede ayudar en la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos preclínicos robustos que reproducen la enfermedad hepática esteatósica asociada a disfunción metabólica (MASLD) humana con fibrosis son esenciales para el descubrimiento traslacional de fármacos y la reducción de riesgos mecanicistas. Este modelo de ratón permite la evaluación cuantitativa de la progresión de la fibrosis y de la disfunción metabólica, lo que respalda la confianza predictiva en la evaluación terapéutica en fases tempranas. Su alineación con la patología de la enfermedad humana mejora la selección de carteras y las decisiones de avance ajustadas al riesgo en las líneas de desarrollo de enfermedades metabólicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de vías fibrogénicas y disfunción metabólica en un sistema relevante para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la modelización de fibrosis progresiva y fenotipos metabólicos.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos para dianas candidatas implicadas en la EHGMC.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona puntos finales histológicos y bioquímicos validados para la cuantificación de la fibrosis.
- Permite la evaluación reproducible de la eficacia de compuestos mediante la tinción con rojo picrosirio y la medición de hidroxiprolina.
- Facilita la estandarización de ensayos para lograr comparabilidad entre estudios y equipos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona resultados preclínicos con la histopatología de la DMHSA humana y los cambios en la expresión génica.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de intervenciones antifibróticas y metabólicas.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al reflejar la progresión de la enfermedad humana.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este modelo conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos activos y la validación preclínica de terapias para la DMAFL al proporcionar puntos finales cuantitativos y relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre mecanismos fibrogénicos y disfunción metabólica in vivo.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y estandarizadas de fibrosis y parámetros metabólicos para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la gravedad de la fibrosis y de los parámetros metabólicos entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Facilita la correlación de hallazgos preclínicos con la patología y la expresión génica humana de la MASLD.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de diversas modalidades terapéuticas dirigidas a la MASLD.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas en la EHGDC.
- Valor operativo: Estandariza la cuantificación de la fibrosis y el fenotipado metabólico para obtener resultados reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la asignación de capital al proporcionar evidencia preclínica sólida.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos para la EHGDC basada en su relevancia traslacional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de animales, tinción histológica y cuantificación bioquímica.
- Necesita acceso a microscopía, espectrofotometría e infraestructura analítica para la medición de los puntos finales.
- Exige la estandarización entre equipos en dieta, cuidado de animales y protocolos de ensayo para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a otras cepas de ratones o regímenes dietéticos puede requerir la optimización del protocolo.
- Debe considerarse la duración del modelo y las líneas de tiempo de progresión de la fibrosis al diseñar el estudio.
