Análisis 3D simultáneo del daño cardíaco y la respuesta inmune en el infarto agudo de miocardio reperfundido mediante microscopía de fluorescencia de hoja de luz

Estamos observando la interacción de las células inmunitarias y el tejido dañado después del infarto de miocardio. Nuestro objetivo es comprender la respuesta inmune y mejorar la función cardíaca. Se propuso que después del infarto de miocardio, las tres entidades celulares principales, los cardiomiocitos y las células y las células inmunitarias deben modularse mediante estrategias multiobjetivo al mismo tiempo.

Además del análisis simultáneo del daño cardíaco y la respuesta, pudimos mostrar la localización 3D de estas áreas dañadas, que antes se desconocía. El análisis 3D, especialmente cuando se multiplexan varios objetivos, proporciona una forma más sólida de evaluar la composición celular después del infarto de miocardio. Para comenzar, coloque el ratón sacrificado bajo un microscopio estereoscópico.

Con unas tijeras finas, abra la cavidad torácica y haga una incisión en la vena cava superior expuesta cerca de la salida del vaso desde la caja torácica hasta el cuello. Usando una aguja de calibre 27 conectada a una bomba de rodillos, perfunda el corazón in situ a través de los oráculos auriculares derecho e izquierdo con PBS que contenga heparina. Confirme la extracción suficiente de sangre cardíaca observando el desvanecimiento de la extracción vascular superficial del corazón y el blanqueamiento del pulmón y el hígado.

Extirpe el corazón junto con al menos cinco milímetros de la aorta restante y el tejido pulmonar circundante con fórceps y tijeras, y transfiéralo a una placa de Petri de seis centímetros precargada con PBS helado y gasa. Ahora, corte el pulmón, la grasa y el tejido vascular restantes hasta que solo quede el corazón con aproximadamente cinco milímetros de aorta. Transfiera el corazón a un plato preparado para la canulación aórtica y tire de la aorta restante sobre una cánula de acero romo de calibre 20.

Asegúrelo a la muesca de la cánula con una bonita sutura 5-0. Levar la arteria descendente anterior izquierda de forma permanente con una sutura 6-0 en el lugar utilizado para la inducción del infarto agudo de miocardio reperfundido. Inyecte 400 microlitros de PBS que contengan 20 microgramos de anticuerpo NT CD31 de ratón, marcados con un LexaFluor 546 retrógradamente a través de la cánula insertada.

Saque con cuidado la cánula de la aorta y transfiera el corazón a un tubo de reacción de polipropileno de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de paraformaldehído al 4%. Incube el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad sin agitación. Lave el corazón fijado en tres cambios de cinco mililitros de PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en la oscuridad, utilizando una rotación casi superior para agitar dentro de tubos de reacción de polipropileno de cinco mililitros.

Deshidrate el corazón fijado en cinco mililitros de etanol al 50% en agua desionizada durante al menos dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad, agitando con rotación casi superior en tubos de reacción de cinco mililitros. Para blanquear el corazón deshidratado, transfiéralo a un tubo de reacción de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de etanol al 100% con sulfóxido de dimetilo al 5% y peróxido de hidrógeno al 5%, e incube a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante cuatro horas sin agitación. Lave el corazón blanqueado en cinco mililitros de etanol al 100% tres veces durante 12 horas cada una a temperatura ambiente en la oscuridad, utilizando una rotación casi superior para agitar en tubos de reacción de cinco mililitros.

Transfiera el corazón a un tubo de reacción de cinco mililitros que contenga cuatro mililitros de cinamato de etilo e incube sin agitación durante tres días a temperatura ambiente en la oscuridad. Corte los bloques de gel y goma de mascar aclarados a un tamaño que estabilice el corazón despejado en el soporte de muestras del microscopio. Utilice una lente de objetivo de apertura numérica de 0.1 con una distancia de trabajo de 17.6 milímetros para la adquisición de imágenes.

A continuación, detecte las señales de fluorescencia utilizando la configuración adecuada del filtro de excitación y emisión. Para imágenes de microscopía de hoja de luz, elija una apertura numérica de hoja de 0.079, lo que da como resultado un grosor de hoja de luz de cinco micrómetros. Establezca la distancia entre dos planos Z individuales en 10 micrómetros.

Utilice un ancho de hoja del 100% para lograr una iluminación homogénea de la muestra. En esta figura se ilustran los cortes de corazón representativos que localizan el área de riesgo, la lesión endotelial y los neutrófilos infiltrados mediante tinción de anticuerpos multicanal y autofluorescencia. El área de riesgo se identificó por la ausencia de tinción de CD31 después de la inyección retrógrada, la lesión endotelial por la negatividad intravenosa de CD31 y la infiltración de neutrófilos por puntos positivos para Ly6G, principalmente cerca de las zonas de lesión.

Las representaciones 3D mostraron superposición entre AAR, lesión endotelial y grupos de neutrófilos, lo que sugiere una localización inmune específica de la región. La cuantificación mostró un 90,2% de neutrófilos en AAR frente al 9,8% en regiones remotas, lo que indica inflamación localizada. Dentro de AAR, el 79,3% de los neutrófilos estaban fuera de los volúmenes de lesión endotelial y el 20,7% dentro, lo que sugiere una agrupación periférica alrededor del daño.