Técnicas eficientes para el muestreo exhaustivo de tejidos accesibles en xenopus adulto

Este trabajo tiene como objetivo crear un método replicable para recolectar rápidamente el ventrículo cardíaco Xenopus, el tronco arterial, el lóbulo hepático izquierdo, la vesícula biliar, el pulmón, el páncreas, el bazo, la laringe, el esófago, el estómago, los intestinos, los testículos, el cuerpo graso, el oviducto, los riñones emparejados, el plexo ciático, la piel, el timo y todo el ojo en menos de una hora. Un desafío experimental es optimizar la frescura del tejido. Por esta razón, el protocolo ha sido diseñado para completarse en menos de una hora. Al priorizar la frescura de los tejidos, estos tejidos se pueden utilizar para completar análisis bioquímicos de alta calidad, como la proteómica, al tiempo que minimizan la cantidad de animales utilizados. En el futuro, escribiremos un protocolo sobre los tejidos a los que es más difícil acceder, como el cerebro, los músculos y los huesos.

[Instructor] Para comenzar, coloque la rana sacrificada para el procedimiento de disección y sujete las extremidades. Con unas tijeras de disección, corte la piel a lo largo de la línea media y luego lateralmente para crear dos colgajos de piel. Con unas pinzas, agarre la línea alba y retírela de la cavidad celómica. Corta con cuidado la musculatura hacia la cabeza y crea dos colgajos de la pared de la cavidad. Reducir los huesos coracoides para obtener un mejor acceso al corazón. Estire el pericardio, perfore y pélelo hacia atrás para exponer las tres cámaras del corazón. Ahora recorte los oráculos en la unión donde se encuentran con el ventrículo y el tronco arterial. Use fórceps para agarrar el vértice del ventrículo y córtelo justo debajo de su unión con el tronco arterial, dejando un margen. Observando la bifurcación del tronco arterial, tire del tronco tenso y corte los troncos aórticos justo después de los puntos donde se dividen en arcos. A continuación, agarre el labio del lóbulo hepático izquierdo y levántelo suavemente para exponer los conductos hepático y cístico. Tome una muestra de los dos tercios inferiores del lóbulo izquierdo debajo de estos accesorios. Después de identificar la vesícula biliar, agárrela y retírela del lóbulo hepático derecho y corte su unión. Luego agarre el vértice del pulmón y tire de él. Corte el pulmón en el límite donde pasa al bronquio. Retire el bronquio de la laringe. Para la extirpación de ovarios, mueva los lóbulos ováricos hacia sus respectivos lados para visualizar los sitios de unión ventrales a los riñones. Con unas tijeras, extirpe los ovarios cerca de los riñones sin causar daño. A continuación, inspeccione el lóbulo anterior del hígado, también conocido como lóbulo mediano, y observe su conexión con el duodeno a través del mesenario. Use tijeras de iridectomía para cortar el ligamento mesentario y hepatoduodenal. La masa carnosa restante es el páncreas y el conducto biliar común. Cortar la conexión del páncreas y el conducto biliar común del lóbulo anterior del hígado, dejando un margen. Sujete el estómago con pinzas dentadas y un extremo del páncreas con pinzas de tejido. Bajo aumento, separe suavemente el páncreas del estómago. Luego identifique el bazo y tome muestras cortando su unión al peritoneo. Sujete la laringe por su extremo inferior y comience a levantarla de la cavidad, cortando las uniones peritoneales a medida que se encuentren. A medida que la laringe está elevada, use tijeras de iridectomía curvas para separar y cortar cuidadosamente el tejido esofágico de la laringe. Luego tire de la laringe hacia abajo y recórtela de la cavidad bucal mientras corta las uniones visibles restantes. Observe la curvatura del estómago, que lo distingue del esófago y la restricción pilórica que marca el inicio del intestino. Corte el tubo digestivo justo antes de la curvatura del estómago para separarlo del esófago. Abra la boca y localice la abertura compartida de las trompas de Eustaquio en su techo. Mientras mantiene la boca abierta, tire del esófago para observar su unión. Luego corte el esófago de la cavidad bucal justo debajo de la abertura de Eustaquio. Luego extirpe el esófago. Ahora agarre el estómago y córtelo en la restricción pilórica donde se conecta con el duodeno. Tire del colon y córtelo lo más cerca posible de la cloaca. Retire los intestinos, cortando cualquier accesorio peritoneal visible en el camino. Si la rana es macho, identifique los testículos y extraiga uno con tijeras de iridectomía, asegurándose de que el riñón permanezca intacto. Separa los cuerpos gordos y colócalos en sus respectivos lados para exponer la unión peritoneal cerca del riñón. Agarra la base de un cuerpo gordo y córtalo del peritoneo, dejando un margen. Para extirpar la vejiga urinaria, corte lo más cerca posible de la cloaca. Si la rana es hembra o tiene un oviducto vestigial visible, agarre el extremo inferior del oviducto y retírelo de la cloaca. Corte el oviducto cerca de la cloaca y luego sáquelo de la cavidad celómica, cortando cualquier inserción peritoneal. Con fórceps, agarre los riñones emparejados retroperitoneales y corte el peritoneo en su base. Levante los riñones fuera de la cavidad, cortando todas las uniones peritoneales. A continuación, agarre el haz de nervios en el plexo ciático con fórceps y corte los nervios donde salen de la cavidad celómica. Levante el haz de nervios y córtelo nuevamente en su conexión con la columna vertebral. Ahora retire los alfileres y voltee al animal sobre su lado ventral. Vuelva a sujetar las extremidades y seleccione una extremidad trasera para el muestreo, sujetando su pie. Extirpe una sección de piel en forma de almendra por encima del gastrocnemio y la región tibio peronea. Sujete la piel dorsal y haga una incisión lateral alrededor de la sección media del animal. Para crear un corte circular continuo. Retire los alfileres, asegure las piernas con una mano y use fórceps con dientes de rata para agarrar la piel dorsal anterior. Despellejar al animal tirando con fuerza de la piel dorsal sobre la cabeza y los brazos. Para tomar muestras del timo, identifique la masa grasa que cubre la articulación de la mandíbula y corte el borde posterior de la masa donde se fusiona con el tejido muscular rosado. Use tijeras de iridectomía para cortar la masa del hueso que revela grupos de melanóforos, si están presentes. Luego recorta el tejido para eliminar cualquier músculo o cartílago. A continuación, vuelva a colocar al animal y seleccione un ojo. Inserte unas tijeras de iridectomía curvas en la órbita y corte suavemente alrededor de la curvatura del ojo para liberar las inserciones musculares. Finalmente, deslice las tijeras más profundamente en la órbita y corte el nervio óptico detrás del ojo. Desaloje el ojo de su cuenca y corte cualquier músculo restante. Al seguir este procedimiento, todos los órganos principales fueron extraídos, enjuagados y recortados dentro de una hora de la eutanasia.