Name: Fabricación reproducible de SPOT como plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprende a fabricar la plataforma SPOT para cultivos de organoides de alto rendimiento. Este protocolo mejora los ensayos de cribado de fármacos y el modelado de enfermedades con manejo líquido automatizado.

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<ol><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture%3A+A+Breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo.</a> Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
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</ol>

A pesar de los avances en la investigación biomédica, el desarrollo de ensayos in vitro fisiológicamente relevantes sigue siendo un desafío. Un ensayo ideal debe adaptarse a una amplia gama de tipos de células, formulaciones de tratamiento, escalas de tiempo, instrumentación comercial y lecturas analíticas para satisfacer las necesidades de los investigadores en diversas disciplinas. Sin embargo, debido a la falta de herramientas adecuadas, los investigadores a menudo confían en modelos simplistas, como monocapas 2D de líneas celulares inmortalizadas, que no recapitulan la complejidad y la relevancia clínica, particularmente en la investigación del cáncer 1,2. Para abordar esto, el biobanco de tumores a gran escala y la colaboración de los médicos han impulsado el desarrollo de modelos in vitro de alta fidelidad, como los organoides tumorales derivados de pacientes (PDO), que conservan perfiles genéticos y terapéuticos más específicos del paciente en comparación con las líneas celulares 3,4,5. Mientras tanto, los avances en la automatización de laboratorios y el descubrimiento de fármacos exigen plataformas que se integren a la perfección en flujos de trabajo de alto rendimiento. Si bien las plataformas existentes abordan la fidelidad biológica o la escalabilidad, pocas han podido resolver ambos desafíos simultáneamente 6,7,8. El desarrollo de modelos automatizados de alto rendimiento que repliquen las características clave de la enfermedad es crucial para avanzar en la investigación biomédica y acelerar la generación de datos para aplicaciones traslacionales.
Numerosos modelos emergentes tienen como objetivo abordar los desafíos asociados con el cultivo de tipos de células especializadas, como las PDO, con un alto rendimiento (Figura 1). Las plataformas estándar, donde los organoides se mezclan con hidrogel en placas de 96 o 384 pocillos, presentan varias limitaciones: (i) el alto volumen de gel celular conduce a un acceso inconsistente a los nutrientes, (ii) la curvatura del menisco del pocillo crea artefactos de imagen y gradientes celulares, (iii) la siembra de hidrogel carece de uniformidad entre lotes y personal, (iv) incompatibilidad con la fabricación automatizada y la microscopía automatizada, y (v) el uso de matriz extracelular (ECM) que suele ser una muestra de riesgo suave y frágil destrucción a densidades fisiológicas de tejido o incorporación de tipos de células contráctiles 1,9. Actualmente, la mayoría de los estudios de PDO basados en placas se llevan a cabo sembrando manualmente el gel celular en la placa10,11, o un método de recubrimiento de gel, donde el hidrogel se diluye con un medio menos viscoso y las células se centrifugan hasta el fondo del pocillo para colocarlas en el plano óptico apropiado12,13. Ambos enfoques no brindan soporte mecánico para el cultivo a largo plazo. Según nuestras observaciones anteriores (datos no publicados), el hidrogel comercial mezclado con células en placas de pocillos estándar se contrae desde las superficies del pocillo durante 9 de cada 12 pocillos durante 12 días, mientras que el método de superposición de gel carece de interacciones fisiológicas entre la célula y la matriz. Además, los cultivos resultantes no se pueden mantener durante largos períodos debido a limitaciones de espacio dentro del pocillo y son incompatibles con ensayos que requieren una alta relación reactivo-medio-célula 14,15,16. Estas barreras prácticas dificultan la adopción de modelos 3D y limitan la reproducibilidad experimental en todo el campo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig1.jpg"> 
Figura 1: Evaluación de modelos de cultivo basados en escalabilidad y relevancia biológica. El posicionamiento relativo de varios sistemas de cultivo in vitro e in vivo a lo largo de la escalabilidad (eje y), definido por el rendimiento de la placa, y la relevancia biológica (eje x), destacando las compensaciones entre el potencial de rendimiento y la fidelidad fisiológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Motivados por estos desafíos, la alta porosidad y el refuerzo mecánico de un andamio de celulosa delgada se aprovecharon para desarrollar la plataforma soportada por andamios para tejidos basados en organoides (SPOT), disponible en formatos de 96 y 384 pocillos. SPOT incorpora un andamio de polímero preestampado utilizando un método de infiltración desarrollado previamente17 que coincide con el diseño de la placa, lo que permite una colocación precisa de las gotas de gel celular y proporciona soporte estructural para la fase de hidrogel (Figura 2A). La absorción capilar en el andamio guía la solución de gel celular, formando una red de biocompuestos aplicada mecánicamente (Figura 2B). Debido a la estructura porosa del andamio, el gel celular se infiltra y forma una capa delgada (aproximadamente 70 μm de espesor), lo que requiere una cantidad diez veces menor de gel celular para cubrir el fondo del pocillo14. La compatibilidad de SPOT con PDO de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) de siembra también se demostró mediante la evaluación de su crecimiento mediante ensayos metabólicos y mediciones basadas en imágenes. Desde su desarrollo, SPOT ha demostrado una versatilidad y facilidad de uso significativas para los investigadores que se dedican al cultivo de organoides. Además, el diseño de SPOT se adapta a una escalabilidad fácil de usar, con volúmenes de reactivos reducidos y capacidades de imagen mejoradas a través de su geometría de microgel plana y sin meniscos, lo que garantiza una penetración uniforme de la luz y una imagen precisa de alto contenido14 (Figura 2C, D). SPOT también apoya el cocultivo con otros tipos de células relevantes, como los fibroblastos, para recapitular mejor el microambiente tumoral18.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig2.jpg"> 
Figura 2: Descripción general del dispositivo 96-SPOT y flujo de trabajo de análisis de imágenes. (A) Representación esquemática de la fabricación de placas SPOT: el dispositivo se ensambla mediante la clasificación de una placa de pocillos sin fondo comercial (arriba), un andamio con patrón de PMMA (que se muestra en azul) y una película de policarbonato (abajo) utilizando capas de adhesivo poliacrílico de doble cara (que se muestra en amarillo). (B) Siembra celular en pozo de andamio: las células se suspenden en un hidrogel no polimerizado (que se muestra en rosa) y se pipetean en cada pocillo donde se infiltra en el andamio. Luego, se permite que el hidrogel se gelifique para encapsular las células dentro del hidrogel soportado por andamios. (C) Microscopía: el microtejido resultante se puede visualizar utilizando microscopía automatizada de campo amplio. (D) Análisis basado en imágenes: Las imágenes adquiridas de células fluorescentes (verdes) suspendidas en gel se pueden analizar utilizando tuberías estándar de análisis de imágenes. Imagen representativa de microscopía de epifluorescencia de células KP4 que expresan GFP en un pocillo 96-SPOT. La barra de escala es de 500 μm. Esta cifra ha sido modificada de14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Otra ventaja de SPOT es que el sistema se puede integrar con un manipulador de líquidos de código abierto, lo que facilita la fabricación automatizada y reproducible de cultivos PDO. Este avance reduce la variabilidad del usuario y respalda diseños experimentales complejos, incluido el cribado de fármacos de alto rendimiento y los enfoques de medicina personalizada18. SPOT también demostró previamente ser compatible con la caracterización multiplexada basada en una sola célula de fenotipos celulares en entornos tumorales heterogéneos y la recuperación de las células a demanda de SPOT por digestión18. Estas características posicionan a SPOT como una herramienta versátil para aplicaciones de detección, donde los datos longitudinales de alta resolución son esenciales para evaluar la eficacia de los medicamentos y el comportamiento celular en condiciones fisiológicamente relevantes14,18. Al combinar estas innovaciones técnicas, SPOT aborda las limitaciones críticas de los sistemas tradicionales de cultivo 3D.
Este protocolo proporciona una guía completa para la fabricación de componentes SPOT, placas de ensamblaje y métodos de siembra para cultivos de organoides 3D robustos y reproducibles. Incluye instrucciones detalladas para la siembra manual de placas mediante una micropipeta y flujos de trabajo de siembra automatizados con un manipulador de líquidos, que admite formatos de 96 y 384 pocillos. Además, este protocolo describe medidas esenciales de control de calidad, como verificar la distribución uniforme del gel y la integridad del andamio, para mantener altos estándares experimentales. También se proporcionan estrategias de resolución de problemas para abordar problemas comunes, como la infiltración incompleta del gel, la evaporación durante la siembra y el desprendimiento del andamio, equipando a los investigadores con soluciones prácticas para optimizar sus flujos de trabajo y lograr resultados confiables.
SPOT está diseñado para llenar los vacíos que enfrentan los ensayos de organoides tradicionales, incluidos los desafíos relacionados con la realización de ensayos y el cambio de medios, al tiempo que preserva la integridad del gel 10,11,12,13. El objetivo general de este método es fabricar una plataforma soportada por andamios que admita el cultivo de organoides durante un período de 12 días. Además, este método también cubre la generación de matrices de tejidos en SPOT a través de la siembra manual o asistida por manipulador de líquidos para permitir a los usuarios realizar cualquier perturbación posterior, incluidos los ensayos IC50 de fármacos y la detección de moléculas pequeñas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 ml (tiras de 8)</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 ml</td><td>FroggaBio</td><td>LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>1000-&mu; Puntas de pipeta L</td><td>Eclipse</td><td>4-1019-260-000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 10 ml</td><td>FroggaBio</td><td>394010</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD, Canadá</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10x Medio esencial mínimo (MEM 10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 150 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Puntas dispensadoras de calibre 16 con conexión Luer lock</td><td>McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos</td><td>6699A2</td><td></td></tr><tr><td>20&micro; Gradillas de puntas de filtro L</td><td>Opentrones</td><td>999-00099</td><td></td></tr><tr><td>200&micro; Gradillas de puntas de filtro L</td><td>Opentrones</td><td>999-00081</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; Puntas de pipeta L</td><td>Eclipse</td><td>4-1030-260-000</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de dosificación de calibre 20 con conexión Luer lock</td><td>McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos</td><td>6699A4</td><td></td></tr><tr><td>Placa sin pocillos de 384 pocillos (negra)</td><td>Greiner</td><td>82051-544</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 3 ml&nbsp;</td><td>BD, Canadá</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 ml</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 ml</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Placa sin pocillos de 96 pocillos (negro)</td><td>Greiner</td><td>82050-714</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Extensión de AxiDraw para Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>API de Python de AxiDraw (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AxiDraw V3 Máquina de dibujo y escritura personal de alto rendimiento</td><td>Científicos Locos Malvados, EE. UU.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno bovino (PureCol 3 mg/ml)</td><td>BioMatrix avanzada</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de elección</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Caballete de clip (incluido en el paquete AxiDraw V3)</td><td>Científicos Locos Malvados, EE. UU.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medios culturales de elección</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de protección que atrapa la suciedad</td><td>3M</td><td>6851 PN36851</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva poliacrílica de doble cara (800 mm x 1200 mm)</td><td>Investigación de adhesivos, ARcare</td><td>90106NB</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de té Finum XL&nbsp;</td><td>Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburgo, Alemania</td><td>420.69.00</td><td></td></tr><tr><td>Tapones planos para tubos de PCR de 0,2 ml (tiras de 8)</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td></td></tr><tr><td>Abrazaderas de resorte de plástico de alta resistencia</td><td>PUNTO DE REFERENCIA</td><td>1024-554</td><td></td></tr><tr><td>Módulo HEPA &ndash; Modelo de 110-130 V y 60 Hz</td><td>Opentrones</td><td>999-00109</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de hielo (congelada, 1400 mm x 1800 mm)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software Inkscape</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora láser</td><td>Sistema láser universal</td><td>VLS3.75</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de acetato de vinilo (EVA) en miniatura de 0.07 pulgadas de diámetro exterior</td><td>McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos</td><td>1883T3</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta electrónica multicanal P20 (Gen2)</td><td>Opentrones</td><td>999-00005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta electrónica multicanal P300 (Gen2)</td><td>Opentrones</td><td>999-00006</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>Sally Hansen</td><td>SBS-006861</td><td>Opcional, para la pigmentación de tinta PMMA</td></tr><tr><td>Opentrons OT-2</td><td>Opentrones</td><td>999-00111</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 8 canales P200</td><td>Gilson</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Compañía Bemis, Inc.</td><td>52859-079</td><td></td></tr><tr><td>Papel pergamino&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Poli(metacrilato de metilo) (PMMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182230</td><td></td></tr><tr><td>Película de policarbonato (760 mm x 1300 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K102</td><td></td></tr><tr><td>Monómero de polidimetilsiloxano y reticulante (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)</td><td>Adhesivos Ellsworth</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de precisión</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Soporte acrílico rígido (tamaño ajustado a la parte inferior de la placa de pocillos)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de cartón rígido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gobernante</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (0,8 M en agua destilada)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de temperatura con bloques de aluminio (Gen2)</td><td>Opentrones</td><td>999-00097</td><td></td></tr><tr><td>Rueda de trazado&nbsp;</td><td>HEEPDD (Amazonas)</td><td>B07YQWB284</td><td></td></tr><tr><td>Cinta transparente&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

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Entrevista: biorreactores y en superficie modificada andamios 3D para la Investigación de Células Madre

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

Los protocolos descritos permiten a los laboratorios realizar cultivos de células madre adherentes y escalables con un rendimiento mínimo con un costo mínimo de inversión en mano de obra, experiencia y equipo utilizando un robot de manejo de líquidos programable y placas de 96 pocillos.  Las iPSCs transitadas más de 20 veces en este sistema mantuvieron la pluripotencia, los cariotipos normales y se diferenciaron en cardiomiocitos.

Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Este protocolo sirve como un tutorial completo para la mezcla estandarizada y reproducible de materiales viscosos con una novedosa tecnología de automatización de código abierto. Se proporcionan instrucciones detalladas sobre el funcionamiento de una estación de trabajo de código abierto recientemente desarrollada, el uso de un diseñador de protocolos de código abierto y la validación y verificación para identificar mezclas reproducibles.

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

Este artículo presenta un protocolo de fabricación para un nuevo tipo de sustrato de cultivo con cientos de microcontenedores por mm2, en el que los organoides pueden ser cultivados y observados utilizando microscopía de alta resolución. También se detallan los protocolos de siembra celular e inmunotinción.

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.

Un sistema de cultivo automatizado para mantener y diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.

Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de

Aprende a fabricar la plataforma SPOT para cultivos de organoides de alto rendimiento. Este protocolo mejora los ensayos de cribado de fármacos y el modelado de enfermedades con manejo líquido automatizado.

Fabricación reproducible de SPOT como plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento

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