Fabricación reproducible de SPOT como plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento

Nuestra investigación se centra en el desarrollo de plataformas de alto rendimiento y soportadas por andamios para cultivos orgonómicos robustos, reproducibles y derivados de pacientes para mejorar el flujo de trabajo de los ensayos de detección de fármacos y ayudar a la modelización avanzada de enfermedades.

Los manipuladores de líquidos automatizados, las plataformas de hidrogel soportadas por andamios, las tecnologías de órgano en un chip y los ensayos unicelulares como la citometría de flujo y los CYTOP son algunas de las tecnologías disponibles actualmente.

Los desafíos actuales incluyen preservar la integridad del hidrogel, superar el menisco del gel para obtener imágenes en tiempo real y garantizar una distribución celular uniforme en ensayos basados en organoides a largo plazo.

Nuestro protocolo permite una carga de hidrogel consistente y soportada por andamios, minimiza los problemas de menisco, admite el cultivo de organoides a largo plazo y se integra sin problemas con manipuladores de líquidos automatizados y sistemas de imágenes de alto contenido.

Estamos muy entusiasmados con el uso de nuestras plataformas de modelado de enfermedades para explorar los mecanismos de progresión de la enfermedad en el cáncer y el desarrollo de la obesidad.

[Instructor] Para comenzar, tome un andamio de patrón de PMMA para 96 o 384 SPOT. Recorta el exceso de papel alrededor de la región azul del andamio, dejando un margen blanco de cinco milímetros alrededor del perímetro. Asegúrese de que la hoja resultante mida aproximadamente 760 milímetros por 1,300 milímetros. Para preparar un andamio 96 SPOT para el montaje, coloque un trozo de película de polietileno sobre un soporte acrílico rígido. Coloque este soporte cubierto de película sobre la superficie de trabajo y coloque el andamio encima de la película de polietileno. Alinee el borde de una regla entre las dos primeras filas del andamio para evitar trazar en los pocillos. Coloque la rueda de trazado en la parte inferior del andamio y gírela hacia arriba hasta la parte superior, guiada por la regla. Para un andamio 384 SPOT, no realice perforaciones. A continuación, coloque el andamio con el lado rugoso hacia arriba sobre una losa de PDMS, asegurándose de que las filas corran horizontalmente. Use la línea de imprimación para determinar qué lado es áspero, luego alise el andamio sobre la losa para eliminar arrugas o burbujas. Retire la capa protectora del lado no grabado de la cinta de doble cara. Abroche ligeramente la cinta en el medio y alinee las dos columnas centrales de la cinta con el andamio. Ahora, presione el centro de la cinta sobre el andamio para asegurar la alineación. Alise la cinta hacia afuera desde el centro para fijarla uniformemente. Con unas pinzas, levante suavemente el andamio de la losa PDMS. Guarde la losa para uso futuro. Para sujetar el andamio a la segunda cinta de pocillos, voltee el andamio de modo que el lado liso y sin cinta quede hacia arriba en el banco de trabajo. Retire la capa protectora central del lado grabado de la segunda cinta para exponer dos columnas centrales. Abroche ligeramente el centro de la segunda cinta y alinéela con las columnas centrales del andamio, luego presione el centro de la cinta para fijarla en su lugar. Si se usa cinta grabada, retire las capas protectoras restantes adyacentes al centro expuesto. Alise la cinta, comenzando desde el medio y moviéndose hacia afuera. Para fijar el andamio a la placa sin fondo, retire la capa protectora. Alinee el andamio debajo de la placa sin fondo con una tapa. Una vez alineado, presione su centro sobre la placa. Si usa cinta grabada, retire las capas adyacentes y alise el andamio sobre la placa hacia afuera desde el centro. Para unir el andamio a la película de policarbonato, use pinzas para aflojar con cuidado la capa protectora de un lado de la película de policarbonato, luego retire lentamente la capa protectora sin causar hendiduras en la película. Repita el proceso para el segundo lado, luego deje la película a un lado en el banco de trabajo. Despegue la capa de cinta protectora del fondo de la placa y presione la película de policarbonato sobre el andamio desde el centro hacia afuera. Luego, presione firmemente la película de policarbonato sobre el andamio para asegurarse de que cada pocillo tenga un borde definido. Con un cuchillo de precisión, corte con cuidado cualquier exceso de material del fondo de la placa. Después del montaje completo, coloque la placa 96 SPOT en una bolsa de plástico transparente y resellable y sáquela del gabinete de bioseguridad. Coloque un soporte acrílico rígido debajo de la placa y sujete ambos en esquinas opuestas. Guarde la placa en un espacio limpio y seco hasta que se use más. No se observó ninguna fuga o intercambio de medios cuando los pocillos alternos en la placa 384 SPOT se llenaron con fluoresceína y PBS durante un período de prueba de 30 días, lo que confirma la eficacia de la barrera de PMMA para mantener el aislamiento de pocillo a pocillo. Los organoides tumorales pancreáticos que expresan GFP sembrados en 96 placas SPOT permanecieron viables y se expandieron progresivamente desde el día cero hasta el día 12 de cultivo. El día 12, los organoides cultivados en SPOT mostraron una fuerte expresión de citoqueratina 19 y Zonula Occludens-1, junto con la presencia de estructuras de luz internas. Los resultados de siembra de tejido subóptimos y óptimos en 384 placas SPOT se distinguieron visualmente por la definición de los bordes y la uniformidad de la distribución celular. Se logró una siembra uniforme y constante en las 96 placas SPOT y 384 SPOT utilizando el manipulador de líquidos automatizado.