Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II

Este protocolo describe un método eficaz para cuantificar la diferencia en el daño del ADN inducido por los inhibidores de tipo I y tipo II en células mutantes FLT3 mediante la aplicación del ensayo cometa.

Empleamos el ensayo cometa para evaluar sistemáticamente la genotoxicidad de los inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II en células mutantes de FLT3 32D, proporcionando datos críticos para la optimización clínica en AML. Durante los procedimientos, el manejo inadecuado de la herramienta de microcirugía alterará el portaobjetos, lo que provocará la pérdida de muestras. La investigación indica que AC220 como inhibidor de tipo II inflige un daño más grave en el ADN sobre las células mutantes FLT3, lo que proporciona información crucial para el desarrollo de terapias combinadas al explotar la vulnerabilidad al daño del ADN para superar la resistencia terapéutica.

Investigar el mecanismo de acción de los inhibidores de FLT3 en el tratamiento de la LMA y desarrollar estrategias de terapia de combinación de dos o múltiples fármacos basadas en inhibidores de FLT3. Para comenzar, prepare una mezcla de 10 a uno de agarosa de bajo punto de fusión y suspensión celular en tubos de 1,5 mililitros con una pipeta y mezcle suavemente. Dispense 55 alícuotas de microlitros de la mezcla de células de agarosa en portaobjetos cometa usando una pipeta sostenida en un ángulo de 45 grados.

Luego, coloque los portaobjetos cubiertos con la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos en un ambiente oscuro. Sumerja los portaobjetos solidificados en una solución de lisis preenfriada e incube durante al menos una hora a cuatro grados centígrados, protegiendo los portaobjetos de la luz. Después de la lisis, retire los portaobjetos de la solución de lisis.

Con una pistola de pipetas, aspire con cuidado la mayor cantidad posible de líquido residual alrededor de la paleta. Luego, coloque los portaobjetos en un tampón de electroforesis alcalina y déjelos preequilibrarse durante una hora a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Ahora, coloque los portaobjetos en la cámara de electroforesis.

Para sumergir completamente los portaobjetos, agregue suficiente solución de electroforesis alcalina preenfriada. Ejecute la electroforesis a 24 voltios con una corriente constante durante 30 minutos utilizando un tampón preequilibrado para reducir el daño al ADN. Después de la electroforesis, use una pistola de pipetas para aspirar el tampón de electroforesis alcalina alrededor del portaobjetos.

Sumerja los portaobjetos en agua destilada doble durante cinco minutos, luego sumerja los portaobjetos en etanol al 70% durante cinco minutos. Coloque los portaobjetos en una incubadora a 37 grados centígrados durante 15 minutos para que se sequen. A continuación, aplique una alícuota de 100 microlitros de tinción de ácido nucleico YeaRed a cada pocillo del portaobjetos.

Incube los portaobjetos durante 30 minutos a 28 grados centígrados en un entorno protegido de la luz. Enjuague los portaobjetos suavemente con agua para eliminar el exceso de manchas y séquelos en una incubadora a 37 grados centígrados. El ensayo cometa se empleó sistemáticamente para cuantificar los perfiles de daño diferencial del ADN inducidos por Gilteritinib y AC220 en líneas celulares mutantes FLT3.

El análisis cuantitativo del porcentaje de ADN de la cola confirmó que ambos compuestos aumentan significativamente el daño del ADN después de dos, cuatro y seis horas, y AC220 produce niveles de daño más altos que Gilteritinib en cada punto de tiempo. Todas las mediciones de la cola de momento reflejaron la tendencia del ADN de la cola con aumentos estadísticamente significativos para ambos tratamientos de dos a seis horas y valores de OTM más altos observados en el grupo AC220 en todo momento.