Name: Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Aprenda a cuantificar el daño en el ADN mediante el ensayo comet en células 32D con mutantes FLT3 tratadas con inhibidores de tipo I y II. Este método revela efectos genotóxicos diferenciales para optimizar terapias en leucemia mieloide aguda.

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1. Construcción de un modelo de daño en el ADN en células 32D con mutaciones FLT3-ITD 18
<ol>
	<li>Recuperación celular<ol>
		<li>Con fórceps, transfiera rápidamente células 32D mutantes FLT3-ITD criopreservadas (almacenadas a -80 °C). Recupere los crioviales con fórceps y sumérjalos inmediatamente en un baño de agua con temperatura regulada (37 °C ± 0,5 °C) durante exactamente 60 s para completar la descongelación controlada. NOTA: Durante la descongelación, agite intermitentemente los crioviales en el baño de agua para asegurar un calentamiento uniforme.</li>
		<li>Centrifugar las muestras criopreservadas a 150 × g durante 5 min a 25 °C ± 1 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con pipetas serológicas estériles mientras retiene el sedimento celular.</li>
		<li>Agregue 1 ml de medio de crecimiento completo (RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino + 1% de penicilina/estreptomicina) al tubo de criopreservación. Realice una trituración suave a través de 10 ciclos de pipeteo secuenciales (volumen de 1 ml) para garantizar una resuspensión completa. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 100 mm y agregue 7 ml de medio completo para lograr un volumen final de 8 ml.</li>
		<li>Agite suavemente el recipiente de cultivo con cinco movimientos horizontales y cinco rotacionales. Mantenga las células en una incubadora humidificada a 37,0 °C ± 0,2 °C con un 5% de CO2 y un 95% de humedad. Incubar durante 24 H antes del procesamiento experimental.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Evaluación de la viabilidad celular<ol>
		<li>Seleccione células 32D mutantes FLT3-ITD en la fase de crecimiento logarítmico con buen estado celular para el experimento. NOTA: Las células en la fase de crecimiento logarítmico suelen tener un ciclo de división corto y una alta frecuencia de división celular.<ol>
			<li>Observe la morfología y el estado de crecimiento de las células 32D con mutación FLT3-ITD utilizando un microscopio electrónico. Asegúrese de que se cumplan los criterios para los umbrales de proliferación celular: busque células che que tengan la forma de un solo glóbulo con bordes lisos, dispersión uniforme, pocos agregados, tamaño celular uniforme, integridad intacta de la membrana plasmática y desechos celulares &lt; del 5%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utilice un contador de células para determinar la concentración de la suspensión celular. NOTA: Mezcle las suspensiones celulares (10 ciclos de pipeteo secuenciales utilizando puntas estériles de 1 ml a una velocidad máxima de pipeta del 50 %).</li>
		<li>Estandarice la suspensión celular a 2.0 × 105 células/ml en medio de crecimiento completo utilizando dilución iterativa. Con una pipeta, dispense alícuotas de 50 μl en los pocillos centrales (B2-G7) de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Llene los pocillos periféricos (A1-H12) con 100 μL de PBS estéril para mantener la humedad y minimizar los efectos de la evaporación de los bordes.</li>
		<li>Preparación del medio que contiene inhibidores de FLT3: seleccione nueve pocillos en una placa de cultivo celular de 12 pocillos y etiquételos de acuerdo con la escala de concentración de inhibidores de FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 y 1000 nM). Agregue 400 μL de medio completo a los pocillos etiquetados como 10.0 μM y 200 μL de medio completo a los pocillos restantes.<ol>
			<li>Dilución de Gilteritinib: Agregue 4 μL de reactivo Gilteritinib de 100 μM (Gilteritinib en dimetilsulfóxido) a cada uno de los pocillos marcados a 1000 nM con una pistola pipeta y mezcle bien la solución. Pipetee 200 μL de Gilteritinib de 1000 nM en los pocillos etiquetados como 500 nM y mezcle; luego pipetee 200 μL de Gilteritinib de 500 nM en los pocillos etiquetados como 250 nM y mezcle. Cada vez, tome 200 μL de la dilución anterior en el siguiente pocillo y mezcle para lograr la concentración deseada.</li>
			<li>Dilución de AC220: Agregue 4 μL de reactivo AC220 de 100 μM (AC220 en dimetilsulfóxido) a cada uno de los pocillos marcados a 1000 nM con una pistola pipeta. Siga el paso 1.2.4.1 para los otros pozos. NOTA: Asegúrese de que la solución madre del inhibidor de FLT3 en la pipeta se transfiera completamente a los pocillos para evitar la solución residual. Asegúrese de que la solución esté bien mezclada antes de proceder con la dilución.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Incubación: Dispense medios que contengan inhibidores de FLT3 en pocillos designados (50 μl/pocillo) con una pipeta. Mantenga la placa de 96 pocillos en condiciones fisiológicas de cultivo (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% de CO2, 95% de humedad) durante exactamente 72 h ± 15 min.</li>
		<li>Alícuota de 10 μl de reactivo CCK-8 a todos los pocillos experimentales y de control en blanco utilizando una pipeta. Proteger la placa de la luz e incubarla en condiciones normóxicas (37 °C, 5% CO2) durante 2,0 h ± 10 min. NOTA: Dispense el reactivo a baja velocidad de pipeta con una profundidad de inmersión de punta de 2 mm para minimizar la formación de burbujas. Evite las burbujas de aire durante la adición de muestras para evitar interferencias con las lecturas de OD.</li>
		<li>Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Registre los resultados.</li>
		<li>Calcule el % de inhibición de acuerdo con la fórmula de cálculo IC50 : Inhibición (%) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq1.jpg" style="margin: auto;"> × 100% El pozo experimental del fármaco denota pocillos celulares tratados con el fármaco. El pozo de control celular denota pocillos celulares que no fueron tratados con el medicamento. Los pocillos de control en blanco indican medio solo sin celdas.</li>
		<li>Analizar los datos normalizados de dosis-respuesta a través de regresión no lineal, empleando un modelo logístico de cuatro parámetros. Haga clic en el botón Curva de ajuste para el ajuste de curvas. Derive la concentración inhibitoria media máxima (IC50) a partir de la convergencia del modelo (R2 &gt; 0,98, suma residual de cuadrados &lt; 0,15) y calcule los intervalos de confianza del 95% a través del remuestreo bootstrap de 1000 iteraciones.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Experimento de daño en el ADN de células 32D con mutación FLT3-ITD inducida por un inhibidor de FLT3<ol>
		<li>Seleccione células 32D mutantes FLT3-ITD que exhiban un crecimiento acelerado (tiempo de duplicación de la población &lt; 24 h) para la evaluación del daño del ADN.</li>
		<li>Cuente las celdas (consulte el paso 1.2.2 para obtener más detalles).</li>
		<li>Siembra celular: Ajuste la densidad de la suspensión celular a 1 ×10 6 celdas por placa, utilizando una placa de 6 cm de diámetro y 4 ml de suspensión celular por placa.</li>
		<li>Prepare tres réplicas para cada concentración de inhibidor: 55 nM de gilteritinib: 4 ml de medio + 2,2 μl de 100 μM de material, 0,15 nM AC220: 4 ml de medio + 6 μl de 100 nM de material. Mezclar las soluciones en vórtice y equilibrarlas a 37 °C durante 15 min; agite suavemente los tubos para asegurar una mezcla adecuada. Aspire el medio original y reemplácelo con 4 ml/plato de medio que contenga inhibidores recién preparado utilizando pipetas serológicas estériles.</li>
		<li>Incubar las células tratadas en condiciones fisiológicas (37 °C, 5% CO2, 95% de humedad) durante intervalos definidos (0, 2, 4, 6 H). Procese los controles de tiempo cero de inmediato para la evaluación de daños en el ADN de referencia.</li>
		<li>Ensayo de exclusión de azul de tripano<ol>
			<li>Centrifugar las células recogidas a 150 × g durante 1 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 1 ml de medio de cultivo.</li>
			<li>Pipetee 100 μL de células resuspendidas en un tubo de centrífuga de plástico, agregue 100 μL de tinción azul de tripano (2x), mezcle suavemente y tiñe durante 3 min.</li>
			<li>Cuente las celdas (consulte el paso 1.2.2 para obtener más detalles).</li>
			<li>Calcule la viabilidad celular de la siguiente manera: %Supervivencia celular = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq2.jpg" style="margin: auto;"> × 100% NOTA: Solo se procesaron muestras con viabilidad ≥90% para el ensayo cometa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparación de reactivos y preparación de muestras celulares
<ol>
	<li>Equilibrar la solución de lisis (que contiene 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1% de Triton X-100, 10% de DMSO) a 4 °C ± 0,5 °C durante 30 min utilizando un frigorífico.</li>
	<li>Derretir la agarosa de bajo punto de fusión (LMA) a 95 °C durante 15 min, luego mantenerla en un baño de agua a 37 °C para evitar la solidificación.</li>
	<li>Prepare el tampón de electroforesis alcalina (300 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, pH &gt;13) pesando 12 g de NaOH con una balanza electrónica, pipeteando 2 ml de solución de EDTA 500 mM y luego agregando ddH2O para hacer hasta 1 L del tampón.</li>
	<li>Recolección de células<ol>
		<li>Recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las suspensiones celulares a 800 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes mediante filtración al vacío.<ol>
			<li>Vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio completo utilizando puntas de pipeta de 1 ml de diámetro ancho, seguidas de 10 inversiones verticales.</li>
			<li>Cuente las celdas como en el paso 1.2.</li>
			<li>Centrifugar la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml a 150 × g durante 5 min para eliminar todo el medio. Vuelva a suspender las células lavadas en PBS sin calcio a ~ 5.0 × 105 células / ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedimiento de ensayo de cometas
<ol>
	<li>Prepare previamente los portaobjetos de ensayo cometa y las muestras de células. Prepare una mezcla 10:1 (v/v) de agarosa LMA y suspensión celular (5 × 105 células/ml) en tubos de 1,5 ml con una pipeta y mezcle suavemente. Dispense 55 μL de alícuotas de la mezcla de células de agarosa en portaobjetos cometa utilizando una pipeta sostenida en un ángulo de 45°, manteniendo una distancia de 2 mm de la superficie del portaobjetos. Colocar los portaobjetos recubiertos con la mezcla a 4 °C durante 30 min para evitar la luz. NOTA: Durante la adición de la mezcla de LMA y células a los portaobjetos de ensayo cometa, dispense la suspensión lenta y uniformemente para evitar la formación de burbujas y garantizar una distribución homogénea del gel.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos solidificados en una solución de lisis preenfriada (que contiene 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1% de Tritón X-100, 10% de DMSO) y realice la lisis durante ≥1 H a 4 °C en condiciones de protección contra la luz.</li>
	<li>Después de la lisis, retire la corredera del lisado y use una pistola pipeta para aspirar la mayor cantidad de líquido posible alrededor de la paleta. A continuación, coloque el portaobjetos en un tampón de electroforesis alcalina (300 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, pH &gt;13) y preequilibre durante 1 h a 4 °C, teniendo cuidado de evitar la luz.</li>
	<li>Electroforesis: Coloque los portaobjetos en una cámara de electroforesis y agregue suficiente solución de electroforesis alcalina para sumergir los portaobjetos. Realice electroforesis a 24 V (equivalente a 0,74 V/cm) con corriente constante (300 mA) durante 30 min utilizando tampón preequilibrado (4 °C) para minimizar el daño al ADN.</li>
	<li>Neutralización: Después de la electroforesis, use una pistola de pipetas para aspirar la solución de electroforesis alcalina del portaobjetos, sumerja los portaobjetos durante 2 x 5 min en dH2O y luego sumérjalos en etanol al 70% durante 5 minutos. Secar los portaobjetos en una incubadora a 37 °C durante 15 min.</li>
	<li>Tinción: Aplicar una alícuota de 100 μL de tinción de ácido nucleico 1x YeaRed por pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en condiciones de protección lumínica. Elimine el exceso de manchas mediante un suave enjuague acuoso seguido de un secado térmico a 37 °C.</li>
	<li>Imágenes: Realice la visualización de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 4x, con adquisición de imágenes digitales realizada en condiciones de exposición estandarizadas.</li>
</ol>
4. Tratamiento de datos
<ol>
	<li>Realice análisis cuantitativos de imágenes para determinar los parámetros estándar del cometa, incluido el ADN de la cola (%), el momento de la cola de oliva y la longitud de la cola (μm).<ol>
		<li>Abra la interfaz del software (Figura 5).</li>
		<li>Importe una imagen en el software, haga clic en Archivo y, a continuación, haga clic en Seleccionar archivo para importar la imagen que desea analizar al software. A continuación, mantenga presionado el botón del mouse y arrastre hasta que aparezca un cuadro azul. Arrastre el cuadro azul para asegurarse de que la celda que desea analizar esté encerrada dentro del cuadro. La opción Ajustar de la figura se puede utilizar para ajustar la posición del marco para incluir toda la celda (Figura 5).</li>
		<li>Antes de iniciar el análisis, haga clic en Iniciar y, a continuación, haga clic en Analizar. Los resultados del análisis de una sola célula se mostrarán en el lado derecho en 'Perfiles'. Después de analizar cada celda, haga clic en Guardar. Los parámetros que se pueden detectar se muestran en el lado derecho de 'Perfiles' y los valores numéricos de varios parámetros se muestran en la parte inferior. Finalmente, haga clic en Archivo | Exportar resultados. Los resultados obtenidos incluyen HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment y OliveTailMoment.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swaminathan, M., Wang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+AML%3A+A+round-up+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for AML: A round-up for clinicians.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).</li>
<li>Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+flt3+mutations+in+AML%3A+Review+of+current+knowledge+and+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence.</a> Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>ST066</td><td></td></tr><tr><td>1x tinción de ácido nucleico YeaRed</td><td>Sí</td><td>10202ES</td><td></td></tr><tr><td>CÉLULA 32D</td><td>Cobioer</td><td>CBP60995</td><td></td></tr><tr><td>AC220</td><td>ObjetivoMol</td><td>T2066</td><td></td></tr><tr><td>Kit de recuento de células-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Placa de recuento de células</td><td>QiuJing</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Termo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>Proyecto de software de ensayo de cometas (CASP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo Comet&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>Citación 5</td><td>BioTek</td><td>16280004</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>CACEROLA</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Gilteritinib</td><td>ObjetivoMol</td><td>T4409</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de alta velocidad</td><td>Termo</td><td>&nbsp; 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>tanque de nitrógeno líquido</td><td>Mvecryoge</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>Fotómetro de microplacas Multiskan FC</td><td>Termo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>Na2OH</td><td>DAMAO</td><td>1588</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Gibco</td><td>C22400500BT</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio trinocular de células vivas</td><td>Movimiento</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>Congelador de temperatura ultrabaja</td><td>Haire</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo comet para cuantificar el daño en el adn en células 32d que expresan mutantes flt3 después de la exposición a inhibidores de flt3 de tipo i y tipo ii

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

El ensayo cometa se empleó sistemáticamente para cuantificar los perfiles de daño diferencial del ADN inducidos por gilteritinib y AC220 en líneas celulares mutantes FLT3. Los análisis mostraron que la diferencia en el daño del ADN entre las poblaciones celulares no tratadas con gilteritinib y AC220 no fue estadísticamente significativa (P &gt; 0,05). Los aumentos dependientes de la dosis en los valores de ADN de la cola (%) y cola de momento oliva (OMT) alcanzaron significación estadística (P &lt; 0,05) después de expos...

Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a class III receptor tyrosine kinase, exhibits a mutation frequency of approximately 30% in acute myeloid leukemia ...

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Investigación

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Biología

El video muestra el ensayo del cometa para detectar daños en el ADN después de la exposición a agentes nocivos. En condiciones alcalinas, el ADN se desenrolla y se desnaturaliza, y tras la electroforesis, el ADN dañado y no dañado migra de manera diferente en el gel de agarosa, formando una estructura en forma de cometa. El ADN no dañado que migra lentamente forma la cabeza circular del cometa, mientras que los fragmentos de ADN dañados que migran rápidamente forman la cola alargada del cometa.

Ensayo Comet para la detección de daños en el ADN en células

El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

El ensayo del cometa es un medio popular para detectar daños en el ADN. Este estudio describe un enfoque para ejecutar diapositivas en variantes representativas del ensayo de cometas. Este enfoque aumentó significativamente el número de muestras al tiempo que disminuyó el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos y el riesgo de daño a los geles.

Un enfoque de ensayo cometario de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria. Aquí se demuestra la forma de inducir DTH activa en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.

Inducción y seguimiento de activos de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en ratas

Las células T reguladoras: potencial terapéutico para el tratamiento de rechazo de trasplantes y diabetes tipo I

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-T de memoria efectora (TEM) de linfocitos. Aquí se demuestra cómo activar antígenos específicos de células TEM, inducir DTH adoptivos en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.

Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas

Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN...

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Aprenda a cuantificar el daño en el ADN mediante el ensayo comet en células 32D con mutantes FLT3 tratadas con inhibidores de tipo I y II. Este método revela efectos genotóxicos diferenciales para optimizar terapias en leucemia mieloide aguda.

Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II (Video) | JoVE Journal

Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II

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