Seguimiento in vivo guiado por imágenes de células progenitoras epiteliales pulmonares distales trasplantadas para fibrosis pulmonar mediante imágenes de partículas magnéticas

Este estudio se centra en el protocolo de intubación intratraqueal como método crítico de administración para la terapia celular pulmonar, con el objetivo de optimizar el trasplante celular y el seguimiento no invasivo mediante imagen por partículas magnéticas en fibrosis pulmonar. Nuestro protocolo aborda la falta de métodos no invasivos para el seguimiento in vivo de la terapia celular en fibrosis pulmonar, combinando aislamiento intratraqueal con imagen por partículas magnéticas para monitorizar la distribución celular. Nuestro protocolo ofrece una entrega celular localizada precisa mediante instalación intratraqueal y un seguimiento superior mediante imagen por partículas magnéticas, proporcionando imágenes en tiempo real de alta sensibilidad sin ruido de fondo.

Para empezar, pesa a un ratón macho NOD o SCID de 12 semanas para calcular la dosis requerida de bleomicina. Preparar la solución de bleomicina en solución salina estéril a la concentración deseada hasta un volumen final de 50 microlitros en un tubo microcentrífuga de 1,7 mililitros. Luego carga la solución en una pipeta.

Precarga una jeringuilla con 200 microlitros de aire para asegurarte de que todo el volumen líquido se expulsa hacia la tráquea durante la inyección. Tras anestesiar el ratón, montar el kit de intubación de fibra ligera con la sonda de fibra óptica enhebrada a través del laringoscopio y el catéter. Pellizca el dedo del pie del animal para confirmar la anestesia adecuada y aplica pomada oftálmica en ambos ojos siempre que el animal esté bajo anestesia.

Suspende al ratón por los incisivos en posición supina sobre un soporte inclinado para intubación de roedores. Usando pinzas romas, agarra la lengua y muévela suavemente hacia arriba y hacia la izquierda para exponer la laringe y lograr una visualización clara. Enciende la sonda de fibra óptica y guíala hacia la boca para acercarse a la tráquea.

Utiliza la lupa del laringuscopio para mejorar la visibilidad e identificar las cuerdas vocales en la abertura de la tráquea. Introduce el catéter en la abertura de la tráquea y retira suavemente el laringoscopio. Luego coloca una gota de 20 microlitros de suero en el extremo superior del catéter.

Coloca la jeringuilla precargada con 200 microlitros de aire y empuja la gota hacia la tráquea. A continuación, carga el catéter con hasta 50 microlitros de bleomicina e inyectarlo con la jeringuilla llena de aire. Mantén el catéter en su sitio durante 5-7 segundos para evitar el reflujo del líquido de la tráquea.

Luego retira suavemente el catéter. Mantén el ratón en el soporte de intubación en la misma posición durante al menos 30 segundos. Luego saca el ratón del soporte y colócalo en una jaula de recuperación sobre una almohadilla térmica.

Vigila al ratón continuamente hasta que se recupere completamente de la anestesia. Obtener células epiteliales humanas de las vías respiratorias marcadas por nanopartículas de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática. 72 horas después de la instalación de la bleomicina, se vuelve a anestesiar al ratón y se repite el procedimiento de instalación intratraqueal para administrar 50.000 células en 50 microlitros de suspensión celular.

Deja que el ratón se recupere al menos 20 minutos antes de la imagen por partículas magnéticas. Coloca la cama del ratón en el escáner de imágenes de partículas magnéticas después de pasar la línea de anestesia por debajo de la cama por los conectores correctos. Mientras el ratón es anestesiado, prepara el escáner de imagen de partículas magnéticas.

Tras confirmar la anestesia adecuada con una prueba de pinzamiento en el dedo del pie, coloca cuidadosamente al ratón sobre la cama de imagen de partículas magnéticas. Empuja la cama con el ratón hacia el tubo del escáner y haz clic en Iniciar escaneo en la interfaz del software para iniciar la imagen. Una vez completado el escaneo, retira el ratón de la cama de imagen de partículas magnéticas y colócalo en una jaula de recuperación situada sobre una almohadilla térmica.

Por último, analiza las imágenes adquiridas utilizando un software de análisis de imágenes. La intensidad de la señal de imagen de partículas magnéticas 2D o MPI aumentó proporcionalmente con la concentración del trazador de óxido de hierro en todos los recuentos celulares probados. Se seleccionó una concentración óptima de marcado de 250 microgramos por mililitro.

La microscopía de fluorescencia confirmó el marcaje in vitro exitoso de las células, mostrando señales de dextrán rojo en el citoplasma y núcleos teñidos de azul con DAPI. Las intensidades de señal en imágenes MPI 2D aumentaron con el número de células marcadas, confirmando una correlación positiva entre la señal y el recuento celular. A partir de esto, se seleccionaron 50.000 células para trasplante.

La imagen vacía del control de la cama no mostraba señal MPI de fondo, confirmando la especificidad del escáner para las celdas marcadas. Las cuatro señales observadas corresponden a marcadores fiduciales usados como controles. El trasplante exitoso de células marcadas en los pulmones produjo una señal MPI distintiva en forma de mariposa con distribución visible en ambos pulmones, validando una entrega intratraqueal efectiva.

La instalación incompleta de la célula provocó la aparición de señales tanto en los pulmones como en la región del cuello, indicando fugas debido a la extracción prematura del catéter. La colocación incorrecta del catéter en el esófago en lugar de en la tráquea hizo que la señal MPI apareciera más abajo en el abdomen, indicando la deposición de células en el estómago. Catorce días después del trasplante, las imágenes ex vivo de los pulmones extirpados confirmaron la persistencia de células marcadas.

Nuestros hallazgos mejorarán la precisión diagnóstica y permitirán el desarrollo de terapias dirigidas para enfermedades pulmonares, incluyendo la terapia con células madre, acelerando el progreso e innovación en la imagen pulmonar y campos biomédicos relacionados. Nuestro laboratorio se centrará en aumentar las terapias basadas en células madre para la fibrosis pulmonar, mejorar las técnicas de imagen no invasivas, al tiempo que se busca optimizar la administración celular y monitorizar la eficacia terapéutica para la fibrosis pulmonar.