Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

Estamos desarrollando nuevos tipos de sondas de hibridación fluorescente para el análisis de ácidos nucleicos específicos de secuencia. Más recientemente, las herramientas de análisis de hibridación se han expandido con ensayos que aprovechan los sistemas CRISPR-Cas. Actualmente, las sondas de hibridación de última generación, como TaqMan, y las sondas de baliza molecular, son las más utilizadas para analizar objetivos de ácidos nucleicos.

La detección precisa de sustituciones de un solo nucleótido y objetivos de ácidos nucleicos sigue siendo prácticamente un desafío. Nuestro protocolo garantiza el nivel requerido de actividad celular al tiempo que proporciona una lectura de señal fluorescente sin etiquetas. Para comenzar, diseñe las secuencias de dos cadenas de oligonucleótidos de ADN no modificadas que constituyen SLAS.

Use un fragmento que contenga nucleótidos para 6 a 39 de DAP-10-42. Convierta el tallo 1 que consta de nucleótidos 1 a 8 y 36 a 42 en el tallo 1 primario eliminando una timina abultada en la posición 5, acortando el tallo a cuatro pares de bases y agregando un par de bases citosina-guanina terminal. Incluya los nucleótidos 9 a 29 en una hebra SLAS y los nucleótidos 30 a 35 en la otra.

Extienda la secuencia terminal de tres primos del fragmento con nucleótidos 9 a 29 agregando desoxi GGTCAT. Luego extienda la secuencia terminal de cinco primos del fragmento 30 a 35 con desoxi TGACC para formar un vástago 2 de seis pares de bases. Ahora extienda el cebo del tallo 1 en ambas hebras con enlazadores TT desoxi y secuencias de ADN complementarias al objetivo del ácido nucleico.

Esto produce las secuencias de hebras SLAS-U y SLAS-S que constituyen la sonda. Haga que SLAS-S sea complementario a una región de 7 a 10 nucleótidos. Eso incluye el sitio de sustitución de un solo nucleótido.

Luego, asegúrese de que el brazo de unión objetivo de SLAS-U sea complementario a un fragmento de 15 a 25 nucleótidos adyacente a la región SLAS-S. Evalúe las temperaturas de fusión de los dúplex de unión objetivo utilizando el servidor web UNAFold. Haga clic en la pestaña INAMelt.

Vaya a Aplicaciones y seleccione Hibridación de fusión de dos estados. Ingrese las secuencias que interactúan en orden de cinco primos a tres primos en los cuadros izquierdo y derecho. Luego ajuste la temperatura del ensayo a 22 grados Celsius e ingrese las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes a 20 milimolares y 25 milimolares, respectivamente.

Ajuste las concentraciones de las secuencias que interactúan en el cuadro correspondiente. Presione enviar y revise los valores de cambio de energía, entalpía, entropía y temperatura de fusión de Gibbs para los dúplex correspondientes. Confirme que las temperaturas de fusión para objetivos perfectamente emparejados y los brazos de unión de objetivos de SLAS-S y SLAS-U estén por encima de la temperatura de ensayo, 22 grados Celsius.

Asegúrese de que el dúplex entre SLAS-S y un objetivo no coincidente produzca temperaturas de fusión por debajo de la temperatura del ensayo para mantener la especificidad. Si es necesario, ajuste las longitudes de los brazos de fijación de destino para cumplir con estas condiciones. Obtenga las hebras de oligonucleótidos SLAS-U y SLAS-S finalizadas de un proveedor comercial de ADN o sintetúrelas internamente utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

Prepare soluciones madre de Auramina O, SLAS-S, SLAS-U y tampón de ensayo. Prepare la mezcla maestra que contiene todos los componentes del ensayo excepto el objetivo. Agregue agua libre de nucleasas al último volumen de cinco por sexto de la mezcla maestra.

Luego haga un vórtice y gire la mezcla maestra. Dispense 50 microlitros en cada tubo de muestra. A continuación, etiquete una muestra como un blanco sin objetivo y otra como un control positivo.

Agregue 10 microlitros de muestra que contiene el objetivo a un tubo que contenga la mezcla maestra para hacer una muestra de 60 microlitros. Para el espacio en blanco, agregue 10 microlitros de agua libre de nucleasas. A continuación, pipetee 10 microlitros de oligonucleótido de ADN sintético que contiene la secuencia diana en el tubo de control positivo.

Mezcle todas las muestras en una centrífuga brevemente con una microcentrífuga. Luego incube los tubos a 22 grados centígrados durante 10 a 60 minutos. Mida la fluorescencia a 540 nanómetros tras la excitación a 475 nanómetros utilizando un espectrofotómetro fluorescente.

SLAS se adaptó para dirigirse a un fragmento específico del gen NANOGP8. El objetivo M era totalmente complementario a la cadena SLAS-S, mientras que el objetivo MM tenía una posición de nucleótido de citosina 1, 423, introduciendo un desajuste con SLAS-S. Tras la adición del objetivo M totalmente complementario, la fluorescencia aumentó de manera constante y se estabilizó después de 45 a 50 minutos.

Sin embargo, una señal clara fue detectable en 10 minutos con una relación señal-blanco de 10 SLAS mostró una señal de alta fluorescencia para objetivos totalmente coincidentes, pero no para objetivos no coincidentes o blancos. La salida de fluorescencia aumentó linealmente con una concentración objetivo de hasta 500 nanomolares, lo que permitió la cuantificación y determinación de los límites de detección. Las muestras amplificadas por PCR mostraron niveles variables de señal y solo la muestra 2 superó el valor umbral de fluorescencia de 2.

Con base en la curva de calibración, la concentración de NANOGP8 amplicón en la muestra 2 se estimó en 124 + o 13 nanomolares. La detección de fluorescencia de la señal SLAS fue consistente tanto en un espectrofotómetro de sobremesa como en un fluorómetro portátil. También se observó visualmente una relación señal/blanco superior a 20 utilizando luz ultravioleta.