Name: Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a diseñar sondas de hibridación divididas con el aptámero fluorescente DAP-10-42 para detectar sustituciones de nucleótido único en ácidos nucleicos. Este método proporciona señales fluorescentes sin etiquetar con alta especificidad.

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1. Diseño del sensor de aptámero de luz dividida (SLAS) con DAP-10-42 como reportero de señal
<ol>
	<li>Diseñar las secuencias de dos hebras de oligonucleótidos de ADN no modificados que constituyen SLAS. Utilice un fragmento que contenga nucleótidos (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tabla 1, Figura 1A).</li>
	<li>Convierta la secuencia del tallo 1 (nts 1-8 y 36-42) en tallo 1' eliminando un residuo de timina abultado en la posición nt 5, acortando el tallo a 4 pb (nts 4,6-8 y 36-39) y agregando un bp C-G terminal (Figura 1A, paso 1). Además, una de las hebras de SLAS contiene nts 9-29 de la secuencia central DAP-10-42, mientras que otra hebra de SLAS contiene nts 30-35 de la secuencia.</li>
	<li>Extienda la secuencia 3'-terminal del fragmento que contiene nts 9-29 con d(GGTCAT), y la secuencia 5'-terminal del fragmento nts 30-35 con d(ATGACC) para formar un tallo 2 de 6-pb (Figura 1A, paso 2). NOTA: Los pares de bases T4-A39, A6-T38, C7-G37 y G8-C36 del vástago 1 en DAP-10-42 son necesarios para la función de iluminación del aptámero. La secuencia del tallo 1' puede modificarse solo en el terminal bp y puede ser un par de bases G-C, A-T, T-A o extendida con 1-2 pares de bases según sea necesario. La secuencia del tallo 2 es arbitraria y se puede cambiar. Sin embargo, se recomienda preservar la estabilidad termodinámica del vástago 2 a menos que la temperatura del ensayo se eleve por encima de 28 °C. El acortamiento o la desestabilización del tallo 2 evita la unión prematura del tinte sin un objetivo si se observa un fondo alto del ensayo fluorescente basado en SLAS. También se permite la división de la secuencia de nucleótidos DAP-10-42 entre nts 28-29, 27-28 o 26-27 en lugar de nts 29-30 (Figura 1B).</li>
	<li>Para adaptar el SLAS diseñado a un objetivo o interés de ácido nucleico, extienda el tallo 1' con secuencias de ADN complementarias a los fragmentos de unión objetivo-objetivo (brazos) a través de enlazadores d(TT) (Figura 1A, paso 3). Esto produce las secuencias de hebras SLAS-U y SLAS-S que constituyen la sonda.</li>
	<li>Haga que el brazo de unión a dianas de SLAS-S sea complementario a un fragmento de 7-10 nt de la diana que contiene el sitio SNS, y el brazo de unión a dianas de SLAS-U, complementario a un fragmento de 15-25 nt del objetivo adyacente al brazo de unión a dianas de SLAS-S (Tabla 1). NOTA: Es opcional si conectar el brazo de unión al objetivo de SLAS-S con nt 4 o nt 39 de la secuencia DAP-10-42 (Figura 1, brazo 1 o brazo 2, respectivamente).</li>
	<li>Evalúe la temperatura de fusión (Tm) de los dúplex entre el objetivo de interés y los brazos de unión al objetivo de SLAS-S y SLAS-U utilizando el servidor web UNAFold (unafold.org)19.<ol>
		<li>Haga clic en la pestaña DINAMelt en la parte superior de la página web; vaya a Aplicaciones y seleccione Hibridación por fusión en dos estados (Figura complementaria 3A). En la página Hibridación de fusión de dos estados, ingrese una de las secuencias que interactúan en el cuadro de la izquierda y otra en el cuadro de la derecha (Figura complementaria 3B). Asegúrese de que ambas secuencias estén en orden de 5' a 3'. Puede introducir más de un par de secuencias que interactúan separándolas con punto y coma.</li>
		<li>En la parte inferior de la página, indique la temperatura del ensayo (22 °C), las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes (20 mM y 25 mM, respectivamente) para que coincidan con las condiciones del ensayo. Indica la concentración de las secuencias que interactúan.</li>
		<li>Presione enviar (Figura complementaria 3B). Observe los resultados que incluyen el cambio de energía de Gibbs, el cambio de entalpía y el cambio de entropía del enlace, así como los valores de Tm para los dúplex correspondientes (Figura complementaria 3B).</li>
		<li>Asegúrese de que los valores de Tm para los dúplex entre el objetivo totalmente coincidente (M) y los brazos de unión al objetivo de SLAS-S y SLAS-U estén por encima de la temperatura de ensayo, que es de 22 °C en el protocolo actual. Aquí, los valores de Tm fueron de 32,2 °C y 74,4 °C, respectivamente (Figura complementaria 3C).</li>
		<li>Asegúrese de que el dúplex entre SLAS-S y un objetivo no coincidente (MM) que contiene un SNS tenga una Tm por debajo de la temperatura de ensayo. Esto asegura una alta selectividad del reconocimiento del objetivo de la sonda, evitando que el fluorógeno AO señale la presencia del analito del ácido nucleico objetivo si contiene un SNS en el fragmento de unión a SLAS (Figura 2). En este caso, la Tm fue de 21,3 °C (Figura suplementaria 3C), lo que fue suficiente para discriminar el desajuste del complejo emparejado.</li>
		<li>Ajuste las secuencias de los brazos de unión al objetivo acortando o extendiendo los fragmentos complementarios al objetivo, si es necesario, para cumplir con los requisitos de estabilidad indicados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obtenga las hebras diseñadas SLAS-S y SLAS-U de cualquier proveedor comercial que suministre oligonucleótidos de ADN hechos a medida o sintetice las hebras de ADN internamente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
Figura 1: Conversión de un aptámero fluorescente con luz (FLAP) DAP-10-42 en un sensor de aptámero iluminado dividido (SLAS). (A)La estructura secundaria de DAP-10-4212 se predice mediante una aplicación de plegamiento de ADN del UNAFold WebServer 19 a 22 °C, 20 mM Na+, 25 mM Mg2+. El aptámero presenta una estructura secundaria de horquilla con un núcleo que presumiblemente se pliega en un motivo G-cuádruple estabilizado por el tallo 1. Para que DAP-10-42 se convierta en un SLAS, (1) el tallo 1 del aptámero se acorta a 4 pb y se flanquea por un g-C bp adicional para hacer el tallo 1'; (2) la secuencia central se divide entre NTS 29 y 30, con los lados 3' y 5' del sitio dividido extendidos con secuencias complementarias d(GGTCAT) y d(ATGACC), respectivamente, para formar el tallo 2; (3) el vástago 1' se extiende con las secuencias complementarias a los fragmentos adyacentes de un objetivo de interés: brazos de unión al objetivo, con un enlazador d (TT) entre los brazos de enlace al objetivo y el dominio de notificación de señal de la sonda. (B) El núcleo también se puede dividir entre nts 28-29, 27-28 o 26-27 sin pérdida significativa de la señal y / o aumento del pliegue de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
Figura 2: Mecanismo de generación de señales SLAS. El SLAS se compone de dos hebras, SLAS-U y SLAS-S, y un colorante fluorogénico (por ejemplo, Auramine O; AO). En ausencia de un objetivo de ácido nucleico de interés, ambas hebras están en estado disociado e incapaces de unirse al tinte; No se observa ninguna señal (centro). En presencia de un objetivo M totalmente coincidente, tanto SLAS-U como SLAS-S se hibridan con el fragmento adyacente de M para acercar los fragmentos del núcleo. Esto permite la formación del sitio de unión del tinte. La unión de AO mejora su fluorescencia, que se mide como una lectura de señal fluorescente (izquierda). En presencia de un MM objetivo no coincidente que contiene una sustitución de un solo nucleótido (SNS) en un fragmento que interactúa con SLAS-S, solo SLAS-U puede hibridarse con el objetivo MM , mientras que SLAS-S está en el estado disociado. Esto evita la formación del sitio de unión del tinte y no se observa ninguna señal (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Amplificación de la secuencia dirigida
<ol>
	<li>Amplificar un fragmento del gen que se va a analizar con el ensayo SLAS. Para la amplificación de PCR o RPA, utilice condiciones asimétricas (por ejemplo, con el cebador directo agregado con un exceso de 10 veces sobre el cebador inverso) para generar un amplicón monocatenario. Para amplificar un fragmento de 126 nt del gen NANOGP8 utilizando PCR lineal después de la exponencial (LATE)20, utilice las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla 2. En este caso, se utilizó una plantilla de ADN monocatenario (Plantilla NANOGP8 o Plantilla G1423C, Tabla 2) correspondiente al fragmento de 126 nt del gen. La plantilla fue sintetizada a medida por Integrated DNA Technologies, Inc.<ol>
		<li>Prepare una reacción de PCR de 100 μL mezclando 10 μL de tampón de reacción Taq estándar 10x, 2 μL de mezcla dNTP de 10 mM (para tener la concentración final de 0,2 mM), 10 μL de cebador directo de 10 μM y 10 μL de cebador inverso de 1 μM (para la concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente), 0,5 μL de 5U/μL de ADN polimerasa Taq, molde de ADN y agua libre de nucleasa. Para un control sin plantilla, agregue agua en lugar de la plantilla.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de (1) desnaturalización a 95 °C durante 15 s, (2) recocido de imprimación a 60 °C durante 30 s, (3) extensión de imprimación a 68 °C durante 30 s; y extensión final a 68 °C durante 5 min. NOTA: Las técnicas de amplificación basadas en transcripción, como NASBA18 , se pueden utilizar en lugar de PCR o RPA, especialmente si se dispone de un molde de ARN para la amplificación. NASBA genera un amplicón de ARN monocatenario a una concentración de producto final en el rango de micromolares, que es lo suficientemente alta como para ser utilizada en el ensayo SLAS posterior sin concentración de producto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Precipitar las muestras amplificadas con etanol añadiendo 0,1x volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,5) y 3x volumen de etanol. Incubar a -20 °C durante 1 h, centrifugar a 12.000-18.000 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Lave el pellet con etanol al 70%, vuelva a centrifugar y deseche nuevamente el sobrenadante. Secar al aire el pellet y disolverlo en 10 μL de agua libre de nucleasas para utilizarlo en el ensayo SLAS.</li>
</ol>
3. Ensayo de fluorescencia mediante SLAS
<ol>
	<li>Prepare soluciones madre de AO (0,1 mM en DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM en agua libre de nucleasas, 10x), SLAS-U (10 μM en agua libre de nucleasas, 10x) y tampón de ensayo 4x (80 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 80 mM KCl). NOTA: Los iones de potasio son necesarios para estabilizar el presunto motivo G-cuádruple del aptámero, que es parte del sitio de unión del colorante. Tan solo 1 mM de KCl (a 25 mM MgCl2) en un tampón de ensayo 1x es suficiente para garantizar un aumento de fluorescencia de ~14 veces en presencia del objetivo específico M sobre el blanco (muestra sin objetivo; Figura complementaria 2B). Los iones de magnesio estabilizan las interacciones de las hebras de ácido nucleico (entre SLAS-S, SLAS-U y el objetivo). La concentración de Mg2+ en el tampón de ensayo 1x debe ser de al menos 5 mM (a 20 mM de KCl; Figura complementaria 2C,D). La solución madre de AO (~1 mM) se prepara en DMSO. Las concentraciones de existencias de SLAS-S y SLAS-U son arbitrarias y pueden ajustarse si es necesario siempre que se mantengan las concentraciones finales de las hebras (véase la justificación de la selección de la concentración final de SLAS en la Discusión). PRECAUCIÓN: El AO es dañino si se ingiere, tóxico en contacto con la piel y se sospecha que causa cáncer. Siempre use guantes cuando trabaje con soluciones de AO. El pesaje de AO y la preparación de sus soluciones madre deben realizarse bajo la cubierta química.</li>
	<li>Prepare la mezcla maestra que contenga todos los componentes del ensayo excepto el objetivo. Calcule el volumen de la mezcla maestra (mezcla V) multiplicando el volumen de la muestra (60 μL) por el número de muestras más uno (n+1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> El número de muestras n debe incluir los controles negativos y positivos necesarios.</li>
	<li>Combine 0,25x Vmix μL de 4x Assay Buffer, 0,1x Vmix μL de 0,1 mM AO, 0,1x Vmix μL de 10 μM SLAS-S y 0,1x Vmix μL de 10 μM SLAS-S. Agregue agua libre de nucleasas al volumen final de <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> tal manera que se adapte al volumen objetivo agregado en el paso 3.4. Vortex y centrifugar brevemente la mezcla maestra. Alícuota 50 μL de la mezcla maestra en n tubos de muestra. NOTA: El volumen de la muestra se puede ajustar en función de las características del instrumento utilizado para detectar la señal fluorescente. El volumen de la mezcla maestra que se alícuota en los tubos de muestra se puede ajustar en función del volumen objetivo añadido en el paso 3.4. El volumen de agua libre de nucleasas agregado para hacer la mezcla maestra debe ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, si la muestra que contiene el objetivo se añade al 10% (V/V) del volumen final de la muestra, se debe añadir agua a la mezcla maestra hasta unamezcla de 0,9x V.</li>
	<li>Utilice una muestra como control sin objetivo (en blanco) y una muestra como control positivo. Añada 10 μL de la muestra que contiene el objetivo a la mezcla maestra (50 μL) para que el volumen final de la muestra sea de 60 μL y contenga un objetivo de 10-1000 nM. Para el blanco, use agua sin nucleasa (10 μL) en lugar del objetivo. Para el control positivo, utilice un oligonucleótido de ADN sintético que contenga la secuencia diana (p. ej., diana M, Tabla 1). Agregue 10 μL de control de 0,6-3 μM para hacer una concentración final de 0,1-0,5 μM. NOTA: La alta fluorescencia en este control positivo garantiza que el ensayo funcione como se espera, incluso si se observa una señal negativa para las muestras desconocidas analizadas.</li>
	<li>Mezcle las muestras y centrifuga con una microcentrífuga. Incubar las muestras a 22 °C durante 10-60 min. La señal aumenta solo en un &lt;15% entre 40 min y 60 min (Figura 3).</li>
	<li>Mida la fluorescencia de las muestras a 540 nm tras la excitación a 475 nm utilizando un espectrofotómetro fluorescente. NOTA: Es posible utilizar un fluorómetro portátil que mide la fluorescencia en tubos de PCR de pared delgada. El fluorómetro debe tener filtros de excitación y emisión adecuados para detectar la fluorescencia AO. Un ejemplo de un filtro de excitación adecuado es un filtro de paso corto de 495 nm. Un ejemplo de un filtro de emisiones adecuado es 510-580 nm. Alternativamente, la señal se puede observar visualmente tras la excitación de la fluorescencia AO en la muestra con una fuente de luz UV o azul. PRECAUCIÓN: Si se utiliza una lámpara UV, use gafas protectoras contra los rayos UV.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
Figura 3: Dependencia del tiempo de la generación de señal para SLAS-29U/30S. Una muestra que contenía AO, SLAS-29U y SLAS-30S se analizó utilizando el modo cinético de un espectrofotómetro fluorescente (excitación a 475 nm, emisión a 540 nm, rendijas de excitación/emisión de 5 nm) durante 60 min. A los 5 minutos (indicado con una flecha), se añadió el objetivo M a la muestra. Los datos se promedian a partir de dos ensayos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stability+of+DNA+duplexes+in+solutions+containing+magnesium+and+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations.</a> Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).</li>
<li>Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+cations+in+G-quadruplex+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal cations in G-quadruplex folding and stability.</a> Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).</li>
<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Auramina O</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>195064</td><td>un tinte fluorogénico utilizado para el informe de señales</td></tr><tr><td>Fluorómetro Cary Eclipse</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>G9800A</td><td>para medir la señal fluorescente de las muestras</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetelia</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>196055</td><td>disolvente para preparar soluciones madre de Auramina O</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos de ADN (cebadores, hebras SLAS, plantilla sintética para PCR)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>hecho a medida y desalado por el vendedor, utilizado sin más purificación</td></tr><tr><td>Mezcla dNTP, 10 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0191</td><td>para reacción de PCR TARDÍA</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>invitrogen</td><td>AM9530G</td><td>componente de búfer; necesario para la correcta asociación de las hebras de la sonda con el objetivo analizado</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>Marca de pescador</td><td>02-681-320</td><td>de plástico para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Micropipeta (0,1-2,5 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K56877G</td><td>Se utiliza para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Micropipeta (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K13160F</td><td>Se utiliza para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Micropipeta (20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>J05253M</td><td>Se utiliza para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Micropipeta (2-20 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>G24675G</td><td>Se utiliza para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Corning&nbsp;</td><td>6770</td><td>Se utiliza para centrifugar las muestras&nbsp;</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas (no tratada con DEPC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9932</td><td>Uso para muestras en ensayos de PCR y SLAS</td></tr><tr><td>Tubos de PCR (0,5 ml)</td><td>invitrogen</td><td>AM9932</td><td>para medir la fluorescencia con el fluorómetro Quantus</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (20-200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td>de plástico para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1-10 uL)</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td>de plástico para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>componente de búfer; necesario para el correcto plegado del dominio del aptámero de luz fluorescente de la sonda</td></tr><tr><td>Fluorómetro Quantus</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td>Fluorómetro portátil de bajo costo que se puede utilizar para mediciones de fluorescencia</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Starna</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>para ser utilizado para la medición de fluorescencia con el fluorómetro Cary Eclipse</td></tr><tr><td>ADN polimerasa Taq con tampón Taq estándar</td><td>Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra</td><td>M0273S</td><td>para la amplificación de un fragmento de gen que se analizará con el ensayo SLAS&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón Tris-HCl (pH 7,4)</td><td>Bioproductos de Boston</td><td>R-314</td><td>Componente de búfer</td></tr><tr><td>Lámpara UV</td><td>UVP</td><td>95-0016-14</td><td>para excitar AO para la observación de señales visuales</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>utilizado para mezclar las muestras</td></tr></tbody></table>

sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de adn como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

El rendimiento de SLAS utilizando el núcleo DAP-10-42 como reportero de señales se demostró utilizando una sonda diseñada para interrogar un fragmento del gen NANOGP8 importante para la progresión del glioblastoma multiforme (GBM), una forma agresiva de cáncer cerebral21. Se informó que este fragmento contenía SNSs en la carga de ADN de exosomas derivados de células cancerosas22. Por lo tanto, el SLAS se adaptó al sitio SNS del gen. Se utilizaron dianas de ADN sint...

Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

DNA-based fluorescent light-up aptamers (FLAPs) are promising for bioanalytical assays because they provide a low-cost fluorescent signal readout without ...

split-hybridization-probe-utilizing-dna-fluorescent-light-up-aptamer

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Demostración de la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando sondas moleculares PicoGreen tinte y Hitachi F-7000 Espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un accesorio lector de microplacas.

La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen

En este vídeo, las células infectadas con viriones MCPyV fueron sometidas a una reacción en cadena de hibridación in situ para detectar genomas específicos de MCPyV. Además, la técnica de ADN-HCR se combinó con FISH para visualizar el ADN MCPyV en células de piel humana infectadas.

HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

Este video describe una estrategia de hibridación secuencial que implica la hibridación de sondas de ARNm con ARNm objetivo específico. Después de la hibridación de la sonda, se realiza una amplificación de la señal para mejorar la resolución a través de la reducción de la relación señal-ruido durante el ARN-CISH de las muestras histológicas.

Hibridación de sonda y amplificación de señal en ARN Hibridación in situ: una técnica para detectar secuencias específicas de ARN en secciones de tejido

Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

Aquí, presentamos un método simple para realizar la hibridación in situ de ADN fluorescente (DNA ISH) para visualizar secuencias heterocromáticas repetitivas en cromosomas montados en portaobjetos. El método requiere reactivos mínimos y es versátil para su uso con sondas cortas o largas, diferentes tejidos y detección con señales basadas en fluorescencia o no fluorescencia.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

Los colorantes de cianina fotoestables se unen a oligonucleótidos para monitorear la hibridación por transferencia de energía.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos son analitos comunes para evaluar sistemas biológicos; sin embargo, el sesgo de la manipulación enzimática puede causar preocupación. Aquí se describe un método para la detección sin marcadores de ácidos nucleicos utilizando polianilina. Esta tecnología de sensores sensible y rentable puede distinguir las diferencias de un solo nucleótido entre moléculas.

Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos

Aprenda a diseñar sondas de hibridación divididas con el aptámero fluorescente DAP-10-42 para detectar sustituciones de nucleótido único en ácidos nucleicos. Este método proporciona señales fluorescentes sin etiquetar con alta especificidad.

Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia (Video) | JoVE Journal

Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

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