Un marco de imágenes multimodal para avanzar en el fenotipado de células vivas de cáncer de mama sin etiquetas

Ahora nuestro protocolo, presentamos imágenes multimodales utilizando microespectroscopía Raman confocal y microscopía de fase tomográfica para un fenotipado morfoquímico rápido e imparcial de células de cáncer de mama humano en su entorno fisiológico nativo. La combinación de microespectroscopía Raman y microscopía de fase de tomografía permite obtener imágenes sin etiquetas en condiciones fisiológicas, proporcionando información bioquímica y morfológica sobre las células y abordando la limitación de los métodos perturbativos convencionales, como el marcado de fluorescencia o la fijación química. Nuestros resultados demuestran un alto potencial de implementación de un enfoque multimodal para proporcionar fenotipado morfoquímico de células de cáncer de mama. Además, su versatilidad, reproducibilidad y no invasividad lo convirtieron en una herramienta prometedora para una amplia gama de aplicaciones biomédicas, desde estudios fundamentales de biología celular hasta diagnósticos.

Nuestro objetivo es crear un atlas de biomarcadores ópticos para el control de calidad embrionario no invasivo, la detección de la senescencia celular y el cribado de fármacos en modelos de organoides para avanzar en la medicina regenerativa y la investigación de enfermedades.

[Instructor] Para comenzar, coloque la muestra de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 en la incubadora en el escenario. Agregue agua para el objetivo de inmersión en agua. Encienda el alimentador de inmersión de agua automatizado para suministrar agua a la lente del objetivo. Verifique regularmente los niveles de agua para evitar la evaporación y garantizar condiciones de imagen consistentes durante las mediciones. Ahora, encienda el láser de la bomba y ajuste su salida para alcanzar una potencia láser de 75 milivatios en el plano de la muestra. Abra el software de control de microscopios Micro-Manager. En los ajustes de configuración, seleccione BF y haga clic en live en el lado izquierdo de la ventana del software. Elija la celda única deseada y, a continuación, haga clic en detener para finalizar la visualización de campo claro. Abra el software de control de la cámara CCD. En la configuración del experimento, establezca el tiempo de exposición en 1,5 segundos. Haga clic en ejecutar en la barra de herramientas del experimento y encienda el rayo láser. A continuación, ajuste la posición Z para maximizar los recuentos de señales en la región de huellas dactilares de 600 a 1,800 centímetros inversos, luego apague el láser. Haga clic en detener en la barra de herramientas del experimento y salga del software. Inicie el proceso de adquisición de datos mediante el script de MATLAB, que gestiona automáticamente los canales Raman en mediciones multidimensionales y guarda los datos. Establezca el campo de visión en 50 por 50 micrómetros cuadrados con una resolución de 40 por 40 píxeles, cada píxel cubre 1,25 por 1,25 micrómetros cuadrados. Establezca el tiempo de exposición para cada espectro Raman en 1,5 segundos y ejecute el script de MATLAB. Para el posprocesamiento de mapas hiperespectrales Raman, inicie la herramienta basada en la web RamApp. Importe los datos hiperespectrales haciendo clic en nuevo en la pestaña mis análisis y cargue el archivo .mat que contiene las variables de datos espaciales y espectrales, junto con la variable del eje X. Para truncar el espectro, en el menú recortar y rotar, elija recorte espectral. Defina los bordes inferior y superior de la región de desplazamiento Raman como 600 y 1.800 centímetros inversos respectivamente. Para corregir los rayos cósmicos, vaya a eliminar el ruido, haga clic en desactivar, seleccione la puntuación Z como método y establezca el umbral en ocho. Marca las opciones de usar la primera diferencia y corregir los picos, luego haz clic en ejecutar para aplicar la corrección. Para eliminar el ruido de los mapas, haz clic en Suavizar mapa, elige el filtro mediano, establece el tamaño del cuadrado en tres píxeles y luego haz clic en ejecutar. Para suavizar el espectro de cada píxel, elija el filtro Savistky-Golay. Establezca la longitud de la ventana de filtro en siete y el orden polinómico en dos, luego haga clic en ejecutar. Para restar la señal de fondo promedio, abra la eliminación óptica del sustrato y haga clic en identificar sustrato. Establezca k-medias como el método con dos clústeres. Luego haga clic en Opciones avanzadas. Elija limpieza morfológica para eliminar pequeñas manchas del primer plano y, a continuación, haga clic en ejecutar. Para eliminar la señal de fondo promedio, haga clic en eliminar sustrato, luego elija el promedio global o la media del método central del 95% de los valores y haga clic en ejecutar. Para corregir la fluorescencia de la línea base, abra el panel de línea base, haga clic en la línea base correcta, seleccione la suavidad adaptativa PLS, luego establezca lambda en 5 millones y haga clic en ejecutar. Para la normalización de cada mapa hiperespectral Raman, vaya a miscelánea, seleccione normalizar, elija el método Frobenius y haga clic en ejecutar. Para generar una imagen en color falso que muestre la distribución subcelular, en el panel de imágenes, haga clic en el símbolo de menú abierto debajo de la imagen de intensidad y, a continuación, haga clic en editar imagen. En el panel de edición, seleccione una sola banda y defina el rango espectral. Ahora, elija el color doble en el mapa de colores, luego defina el color, el umbral de intensidad y la opacidad antes de hacer clic en confirmar. Para la descarga de un espectro de un solo punto, elija un píxel de interés y, a continuación, en el panel de leyenda espectral, haga clic en descargar espectro. Por último, para exportar los espectros de primer plano y de sustrato, vaya a la leyenda espectral y, a continuación, haga clic en descargar espectro para las secciones de primer plano y de sustrato. Coloque una gota de agua destilada en la lente del objetivo del microscopio. Coloque la muestra en la platina de traslación del microscopio y, a continuación, ajuste la posición de la muestra para alinearla con la lente del objetivo. Encienda el microscopio e inicie el software de imágenes. Haga clic en el icono del microscopio en la barra de herramientas. Después de la inicialización, haga clic en configuración, seleccione celda activa en el panel de trabajo y PBS como medio. A continuación, acceda a la pestaña de calibración en el panel de control del software de imágenes. Establezca las posiciones axiales de las lentes del objetivo y del condensador seleccionando el enfoque y la superficie respectivamente. Ahora, haga clic en el modo de escaneo para ajustar manualmente las lentes y asegurarse de que los patrones de iluminación estén centrados y casi estáticos. Elija el modo normal y, a continuación, ajuste la etapa de traslación para llevar la celda al campo de visión y centrarse en la muestra. Ajuste la etapa de traslación para localizar una región sin celdas. Elija calibrar para capturar varios hologramas 2D en diferentes ángulos de iluminación. Ajuste la etapa de traslación para centrar la celda, luego navegue a la pestaña de adquisición y seleccione instantánea 3D para capturar el tomograma de la célula. Para visualizar los tomogramas holográficos, seleccione los datos en el panel de navegación de datos, haga clic con el botón derecho y haga clic en abrir. En el panel del administrador de datos, haga clic en Tomograma de RI. En el panel de visualización de volumen, seleccione RI y dibuje cuatro cuadros de color rectangulares dentro del lienzo de RI. Establezca los valores mínimo y máximo del rango de instancias reservadas para cada cuadro de color y, a continuación, asocie una opacidad y un color con cada cuadro. Haga clic en Guardar para almacenar los rangos de instancias reservadas y los cuadros de color definidos. Para obtener descriptores cuantitativos de la morfología celular, utilice la interfaz de análisis. Seleccione manual en el panel de segmentación, luego establezca 1.3450 como umbral de RI y haga clic en aplicar. Haga clic en Guardar para guardar los índices morfológicos calculados. El mapeo espectral Raman reveló la distribución espacial del citoplasma, el núcleo, la fenilalanina y los lípidos dentro de las células MDA-MB-231 individuales. Se confirmaron distintos picos espectrales Raman correspondientes al citoplasma, el núcleo, la fenilalanina y los lípidos en la región de huellas dactilares entre 600 y 1.800 centímetros inversos. Los mapas de calor del índice de refracción de células individuales revelaron la distribución interna de los componentes subcelulares en el plano axial XY, el plano sagital YZ y los planos coronal XZ. Una reconstrucción tomográfica 3D identificó regiones de índice de refracción volumétrica correspondientes a subestructuras internas. Las mediciones morfológicas cuantitativas de una sola célula MDA-MB-231 mostraron diferentes descriptores de morfología celular, con un volumen total de 4024.189 micrómetros cúbicos y un área de superficie de 2383.707 micrómetros cuadrados, con un índice de refracción medio de 1.356.