In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

Paramecium es un eucariota unicelular con dimorfismo nuclear. En su núcleo de línea germinal, muchos genes codificadores de proteínas son interrumpidos por secuencias similares a transposones que deben eliminarse en el núcleo somático. Esto requiere complejos multiproteicos en un proceso dinámico.

Una estrategia eficiente para estudiar una maquinaria molecular tan intrincada es la biotinilación por proximidad. En nuestro enfoque, podemos insertar cualquier gen diana aguas arriba de la turboID ligasa para crear una proteína de fusión. Luego, esta construcción debe inyectarse en el núcleo somático del paramecio, como se demuestra en el siguiente protocolo.

Para este protocolo se utiliza hoy en día, células que se han recuperado en medio de cultivo fresco. Utilice un microscopio estereoscópico para capturar las células con la pipeta y transferirlas a un campo de portaobjetos de depresión fresco con medio de lavado. Mientras las células están en el medio de lavado, disperse 20 microlitros de agua en el portaobjetos de vidrio y cúbralo con el cubreobjetos.

Agregue 200 microlitros de aceite mineral encima del cubreobjetos. Después de esto, transfiera las células individuales del portaobjetos de lavado como gotas debajo del aceite mineral. Coloque el portaobjetos preparado en el pedestal del microscopio de inyección.

Coloque la aguja de aspiración y muévala a su posición. Activa el brazo robótico y el microinyector FemtoJet. Utilice una punta de pipeta de microcargador para agregar el ADN dentro del capilar de la aguja de inyección.

Conecte la aguja de inyección al sistema de inyección, luego muévala a su posición y conéctela al FemtoJet. Utilice el brazo robótico para colocar la aguja de inyección dentro de una gota de agua. Luego presione para limpiar para purgar la aguja hasta que el flujo de ADN sea visible.

Pase a una gota que contenga una célula y baje la aguja de aspiración. Luego aspire suavemente el agua hasta que la célula esté inmovilizada. Levante la aguja de aspiración y baje la aguja de inyección.

La aguja de inyección debe insertarse en un área más oscura correspondiente al núcleo somático. Una gota difusa puede hacerse visible dentro de los límites del núcleo somático tras una inyección exitosa. Después de la inyección, use la aguja de aspiración para devolver el agua a la célula.

A continuación, cada célula inyectada debe recuperarse en un pocillo lleno de medio de cultivo. Después de expandir las células, es necesario validar la presencia del ADN inyectado. Por lo general, se espera una tasa de éxito del 40 al 50% con este procedimiento.

También es necesario validar la expresión exitosa de proteínas del ADN inyectado, así como su correcta localización mediante tinción inmunofluorescente. Aquí, mostramos el uso exitoso de una proteína NOVA1 fusionada con una biotina ligasa turboID para el etiquetado de proximidad durante diferentes etapas de desarrollo en paramecio. En particular, la biotina suplementaria aumenta la biotinilación en las células que expresan una proteína de fusión turboID.

Sin embargo, la adición de biotina a las células de tipo salvaje no conduce a la biotinilación. Como era de esperar, la biotina se une covalentemente a varias proteínas, como se muestra en el análisis de Western blot. Finalmente, utilizamos perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina para demostrar que las proteínas biotiniladas pueden enriquecerse selectivamente a partir de un lisado de paramecio.

Desarrollamos un método para el marcado de biotina de proteínas in vivo in paramecium. Este método se adapta rápidamente a cualquier gen de interés. La biotinilación específica de la etapa se puede lograr mediante el momento de la suplementación con biotina.