Name: In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprende biotinilación de proximidad in vivo en Paramecium tetraurelia usando turboID ligasa. Este método permite estudiar interacciones proteicas mediante enriquecimiento selectivo con perlas magnéticas.

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<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
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<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
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<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
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<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscopio Axiovert 40 CFL (lentes 10x, 40x)</td><td>Zeiss</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>B-sitosterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Referencia A9647</td><td></td></tr><tr><td>Aceite CellTram</td><td>Ependorf</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>Secuencia de ADN 3xHA-turboID optimizada para codones</td><td>Twist biociencia</td><td>Na</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCCTTACGAT GTTCCTTATATGCTTATCCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAACAC TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGTGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTTGTT GACTCAACTAATCAATATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTTTCTCTCTTTTTTTTTTT GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT AGAAACACTTTAGCTGCTCTCTCA TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer Scientific</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de microcargador epT.I.P.S.</td><td>Ependorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Grogg Chemie</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Ependorf</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>Femtotip II</td><td>Calibre Científico</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Aplicación química</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Etiqueta HA (C29F4) mAB de conejo</td><td>Sistemas celulares</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI 2</td><td>Ependorf</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>medio ligero</td><td>Na</td><td>Na</td><td>0,2x solución de polvo de hierba de trigo en 2,5 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8691</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-cloroformo-isoamilacol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fósforo&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>Kit de plásmido más midiprep</td><td>Qiagene</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>medio rico</td><td>Na</td><td>Na</td><td>1x solución de polvo de hierba de trigo en 2,5 mM de Na2HPO4</td></tr><tr><td>Estreptavidina-FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Ultrafree-MC GV&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lavado</td><td>Na</td><td>Na</td><td>0,1% BSA en Volvic water&nbsp;</td></tr><tr><td>solución de polvo de hierba de trigo</td><td>Pinos internacionales</td><td>Na</td><td>Preparar como un caldo 20x del polvo como se describió anteriormente (0,5 g / 10 ml)</td></tr><tr><td>Estreptavidina-HRP</td><td>abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnáticas recubiertas de estreptavidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis para pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM de NaCl; 0,5% de desoxicolato de sodio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x inhibidor de la proteasa cOmplete (Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>Lavado del tampón 1 para pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM de NaCl; 0,5% de desoxicolato de sodio; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;</td></tr><tr><td>Lavado del tampón 2 para pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>10 mM Tris pH 7,4; 150 mM de NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Lavado del tampón 3 para pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>10 mM Tris pH 7,4; 150 mM de NaCl;</td></tr></tbody></table>

in vivo biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en paramecium tetraurelia

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

Nuestro protocolo describe un método simplificado para la introducción de una modificación covalente de biotina en las proteínas en las proximidades de una proteína diana en Paramecium (Figura 1A). Estas proteínas biotiniladas pueden enriquecerse aún más mediante un pulldown de estreptavidina e identificarse mediante espectrometría de masas20. Para demostrar un caso de uso práctico del método, aplicamos el protocolo a la proteína Nowa1. Esta proteína es esencial para el proceso de reordenamiento genómico y tiene alteraciones dinámicas en su localización12. En las primeras etapas, permanece en el antiguo núcleo somático y fragmentos, pero luego se localiza en el nuevo núcleo en desarrollo. En particular, nuestros intentos anteriores de un enriquecimiento mediado por etiquetas de las proteínas que interactúan con Nowa1 no tuvieron éxito (resultados no publicados). Esto probablemente se debió a las repeticiones complejas que tienen similitud con la proteína priónica PrP27 que podría causar autoagregación en condiciones no óptimas durante el procedimiento de pulldown21. La PCR amplificó la región codificante de Nowa1 junto con su región no codificante aguas arriba que contiene el promotor. Luego, el producto se insertó en un marco con una secuencia de codificación turboID optimizada para codones (Figura 1B). Para evitar el silenciamiento inducido por transgenes causado por la inyección de ADN circular en Paramecium, el vector se linealizó antes de la inyección. Luego, el ADN linealizado y purificado se microinyectó en el núcleo somático (MAC) como se describe en este protocolo. Una gota dispersa confinada dentro de la región más oscura del núcleo somático se hizo visible en algunas de las inyecciones exitosas (Figura 1C). La inyección exitosa y la amplificación del ADN por parte de las células durante la división celular se verificaron mediante PCR. Como se esperaba, el 40-50% de las células fueron positivas para el ADN inyectado de la construcción Nowa1 (tamaño esperado del producto 685 pb) (Figura 2). El siguiente paso fue verificar la presencia de la proteína codificada por el ADN inyectado. Dado que el vector receptor contiene la secuencia turboID flanqueada por una etiqueta triple de HA, utilizamos tinción de inmunofluorescencia para detectar la etiqueta. Esto nos permitió verificar si las células inyectadas están expresando la proteína de fusión y si estaba localizada correctamente. Utilizamos células en etapa tardía que mostraron la localización de la proteína de fusión en los dos nuevos núcleos en desarrollo, como se observó anteriormente para la proteína Nowa1 de tipo salvaje12. Las líneas celulares inyectadas individuales mostraron diferentes niveles de la proteína de fusión (Figura 3). Un nivel de expresión más bajo puede ser beneficioso para aplicaciones en las que es deseable un fondo reducido, pero en este caso, optamos por la señal máxima y procedimos con el clon 2, que mostró la expresión más alta. Luego recolectamos muestras durante diferentes etapas de desarrollo para rastrear la localización de la proteína de fusión. La proteína se localizó inicialmente en las madejas formadas a partir del antiguo núcleo somático y en los fragmentos nucleares separados durante las primeras etapas de la autogamia. Tras la aparición del anlagén nuclear, la proteína de fusión hizo la transición hacia estos nuevos núcleos en desarrollo (Figura 4). Para fomentar la biotinilación del proteoma proximal en las diferentes etapas, complementamos el cultivo con biotina de 500 μM durante 2 h antes de cosechar las células para IF. Visualizamos las proteínas marcadas con biotina a través de una tinción IF utilizando una estreptavidina marcada con fluorescencia. La señal observada correspondió a la localización de la proteína de fusión marcada con HA. Es importante destacar que fue posible obtener una localización de biotinilación específica para las diferentes etapas de desarrollo nuclear, ya que incluso una incubación corta con biotina es suficiente para lograr una biotinilación significativa (Figura 4). Además, sin la adición de biotina suplementaria, solo se detectó una biotinilación insignificante en las células inyectadas. En las células de tipo salvaje, la adición de biotina suplementaria no causó biotinilación detectable (Figura 5A). En particular, la biotina no se acumulaba simplemente en el núcleo en desarrollo, ya que incluso en condiciones de desnaturalización, permanece unida a las proteínas. (Figura 5B). Utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, fue posible enriquecer selectivamente las proteínas biotiniladas (Figura 6). Las proteínas enriquecidas se pueden identificar mediante espectrometría de masas. En estos experimentos posteriores de identificación de proteínas, el cultivo no suplementado, así como las células que expresan una proteína turboID no fusionada, se pueden utilizar como grupos de control de fondo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del procedimiento para la biotinilación por proximidad en P. tetraurelia. (A) Esquema generalizado del protocolo. (B) Principio de clonación para el vector receptor turboID plug-and-play y la construcción resultante para la proteína de fusión Nowa1. La región 3'UTR utilizada en este plásmido se deriva de CenH3a. (C) Gota difusa visible contenida dentro del área más oscura correspondiente al núcleo somático (MAC) tras una inyección exitosa de ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
Figura 2: Prueba de PCR para inyección exitosa. Análisis en gel de agarosa de la reacción de PCR para un producto con un cebador directo específico para la región aguas arriba que codifica la resistencia a la ampicilina (amperios de inicio) y un cebador inverso complementario a Nowa1. La punta de flecha muestra el tamaño esperado del producto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
Figura 3: Tinción de inmunofluorescencia para validar la localización correcta de la proteína de fusión turboID. Tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpo primario anti-HA de conejo (1:100) y anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 568 anti-conejo de cabra (1:1000) de líneas monoclonales de Paramecium con una señal de PCR positiva para el ADN que codifica una proteína de fusión Nowa1-HA-turboID. Escala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
Figura 4: Biotinilación específica de Nowa1 en diferentes etapas de desarrollo. Tinción de inmunofluorescencia de la línea monoclonal 2 en etapas progresivas durante la formación del nuevo núcleo somático. El medio de cultivo se complementó con 500 μM de biotina para una actividad óptima de turboID. Se detectó la etiqueta HA como en la Figura 3 y la biotina se detectó con Streptavidin-FITC (1:200). Escala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
Figura 5: El marcado de proximidad eficiente por turboID requiere biotina suplementaria en el cultivo. (A) Tinción de inmunofluorescencia de wt y células inyectadas en la etapa tardía de desarrollo que muestra la expresión de Nowa1-HA-turboID y la biotinilación observada con biotina suplementaria de 500 μM. Se detectaron la etiqueta HA y la biotina como en la Figura 4. Escala 20 μm. (B) Análisis de Western blot para biotina utilizando HRP-estreptavidina de células wt cultivadas con biotina de 500 μM y células inyectadas con turboID con y sin biotina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
Figura 6: Enriquecimiento de proteínas biotiniladas con perlas magnéticas de estreptavidina. Análisis de Western blot para biotina de muestras de un experimento pulldown utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Las muestras son: Lisado celular Nowa1-HA-turboID (entrada), la fracción no unida (flujo), los pasos de lavado (lavado 1-6) y las proteínas unidas a las perlas (salida). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

En este estudio, establecemos un protocolo detallado para el marcaje de proximidad (PL) basado en TurboID en el ovario de D. melanogaster , que abarca desde la suplementación con biotina y la disección ovárica hasta la validación de la expresión transgénica y el enriquecimiento de péptidos biotinilados para la espectrometría de masas.

In vivo Aplicación del etiquetado de proximidad basado en TurboID en Drosophila melanogaster

Aprende biotinilación de proximidad in vivo en Paramecium tetraurelia usando turboID ligasa. Este método permite estudiar interacciones proteicas mediante enriquecimiento selectivo con perlas magnéticas.

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

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