Name: Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a generar genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante enriquecimiento de objetivos. Este protocolo permite la vigilancia genómica de patógenos de ITS como Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
<li>Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of infectious pathogens.</a> JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).</li>
<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
<li>Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+beginner%27s+protocol+for+whole+genome+sequencing+of+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens.</a> J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).</li>
<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
<li>Didelot, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+laboratory+maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Pipeta de 8 canales 0,5-10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000010</td><td>Investigación de Eppendorf&nbsp; más, 8 canales, 0.5-10 &micro; L, gris medio, volumen variable.</td></tr><tr><td>Pipeta de 8 canales 10-100 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>Investigación de Eppendorf&nbsp; Además, 8 canales, 10-100 &micro; L, amarillo, volumen variable.</td></tr><tr><td>Combinación de oligoelementos del adaptador para bibliotecas etiquetadas con MBC</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos mediante un kit de extracción de ADN viral/patógeno</td><td>Qiagen</td><td>937036 (Kit) / 9001297 (Instrumento)</td><td>Instrumento QIAsymphony SP/AS utilizado con el kit QIAamp DSP Virus/Pathogen para la extracción automatizada de ADN.</td></tr><tr><td>Búfer de enlace</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).</td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN e instrumento automatizado</td><td>Corporación de Investigación Zymo</td><td>D3024/D3025</td><td>Kit de minipreparación de ADN rápido utilizado para la extracción total de ADN de muestras clínicas. Compatible con flujo de trabajo manual o automatizado.</td></tr><tr><td>End Repair: una mezcla de enzimas de cola</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Amortiguador de cola de reparación final</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Productos químicos VWR BDH</td><td>20816.298</td><td>Absoluto de etanol &ge; 99,5% Doctorado en Euros, USP</td></tr><tr><td>Fluorómetro con ensayo de dsDNA de alta sensibilidad / Método basado en fluorescencia para cuantificar el ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Fluorómetro Qubit 4 con kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) 1X dsDNA.</td></tr><tr><td>Búfer de fragmentación</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Parte del kit de fragmentación enzimática SureSelect con el nombre ''Buffer de fragmentación 5X''.</td></tr><tr><td>Enzima de Fragmentación</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Parte del kit de fragmentación enzimática SureSelect.</td></tr><tr><td>Tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (Pre PCR) con el nombre ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad con dNTP (5X)</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzima de fusión de alta fidelidad para amplificación por PCR</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5191-5688</td><td>Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>Tampón de lavado a alta temperatura</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Wash buffer 2''.</td></tr><tr><td>Tampón de hibridación</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Manuales de secuenciación indexada</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte de los pares de cebadores de índice SureSelect XT HS2 1-96 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Ensayo de PCR multiplex en tiempo real interno</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>Ensayo desarrollado y acreditado internamente basado en kits Lightmix para la detección de ITS</td></tr><tr><td>Tampón de ligadura</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas para limpieza</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5191-5740</td><td>Perlas SureSelect DNA AMPure XP.</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Material de laboratorio Permagen</td><td>MSRLV08</td><td>Separador magnético de 8 tiras de PCR de 0,2 ml 5 &micro; L ~0,2 ml de volumen.</td></tr><tr><td>Secuenciación de próxima generación (NGS): sistema de secuenciación de lectura corta de alto rendimiento&nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>Secuenciación de 150 pb de extremo emparejado (PE150) realizada en las plataformas Illumina NextSeq1000 y MiSeq.</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>BioConcept</td><td>3-07F04-H</td><td>Agua para biología molecular, libre de ADN/ADNasa/RNasa, estéril, libre de inhibidores de PCR.</td></tr><tr><td>Mezcla de bloqueadores de oligonucleótidos</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Tira de tubo de PCR</td><td>avantor, entregado por VWR&nbsp; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>Tiras de tubo de PCR con tapas planas adjuntas.</td></tr><tr><td>Mezcla de imprimación posterior a la captura</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).</td></tr><tr><td>Sonda de ARN</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>Sonda SureSelect Custom Tier4 de 6 Mb-11,9 Mb, por ejemplo, ID de diseño S3465164).</td></tr><tr><td>Bloqueador de ARNasa</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Tampón de lavado a temperatura ambiente</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Kit de enriquecimiento de objetivos SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con el nombre ''Tampón de lavado 1''.</td></tr><tr><td>Perlas de estreptavidina</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5191-5742</td><td>Perlas de estreptavidina SureSelect.</td></tr><tr><td>ADN ligasa T4</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit de preparación de bibliotecas SureSelect XT HS2 para ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Método de enriquecimiento de objetivos / método de captura de ADN</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>G9983-90000</td><td>Kit de ADN SureSelect XT HS2 con preparación de bibliotecas, enriquecimiento rápido de objetivos y flujo de trabajo de agrupación posterior a la captura. Versión de protocolo F0, mayo de 2023. Para Illumina Platform NGS</td></tr><tr><td>Conjunto de sondas de enriquecimiento objetivo para C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum y M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Laboratorio de Microbiología Enriquecedora (IMM, UZH)</td><td>ID de diseño S3465164</td><td>Conjunto de sondas diseñado a medida (~242.000 sondas) para la captura múltiple de cuatro patógenos de ITS. Diseño basado en múltiples genomas de referencia.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Termofischer</td><td>4375305</td><td>Termociclador Veriti de 96 pocillos.</td></tr></tbody></table>

generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Un estudio sobre el brote de LGV de C. trachomatis en Buenos Aires, Argentina, mostró algunas características novedosas en las muestras, a saber, 10 sustituciones de nucleótidos en el gen ompA en comparación con el genotipo L1 de ompA, y una secuencia inusual de tipificación de secuencias multilocus (MLST) tipo 2 17,18,19. Nuestro objetivo era investigar los genomas de estas muestras clínicas, colocándolas en el contexto de los datos globales. Para lograr esto, comparamos el rendimiento de un enfoque de enriquecimiento objetivo con la secuenciación metagenómica directa para WGS de ITS bacterianas de muestras clínicas, en un intento de superar los desafíos planteados por las bajas cargas bacterianas y la abundancia de ADN humano y microbiano.
El ADN utilizado fue de muestras de hisopos rectales recolectadas entre 2017 y 2023 en Buenos Aires, Argentina, colocadas en medio 2-SP (medio sacarosa-fosfato) suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 2% y antibióticos (gentamicina 25 μg/mL, vancomicina 0,5 mg/mL y anfotericina B 2,5 μg/mL) y almacenadas a -80 °C, o uretrales, anorrectales, e hisopos faríngeos recolectados en el Hospital Universitario de Zúrich (USZ) en tampón NAAT (pruebas de amplificación de ácidos nucleicos). El ADN de las muestras de Buenos Aires se extrajo utilizando un kit de extracción manual a base de sílice, mientras que el ADN de las muestras USZ se extrajo utilizando un sistema automatizado basado en perlas magnéticas.
Todas las muestras clínicas incluidas en este estudio se confirmaron positivas mediante un ensayo de PCR en tiempo real multiplex desarrollado internamente (ver Tabla de materiales) con valores de umbral de ciclo (Ct) de qPCR que varían de la siguiente manera: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 y M. genitalium:  30-37. La concentración de ADN se cuantificó mediante un ensayo fluorométrico de alta sensibilidad antes de la secuenciación para caracterizar el material de entrada de las muestras clínicas (ver Tabla de materiales).
Para comparar la secuenciación metagenómica directa con el enriquecimiento objetivo, utilizamos 32 muestras, de las cuales 29 fueron positivas para C. trachomatis, nueve para N. gonorrhoeae, cinco para T. pallidum y tres para M. genitalium. La secuenciación metagenómica directa no dio como resultado ningún genoma completo y, de hecho, apenas logró datos objetivo por encima de la línea de base observada en muestras negativas. El enriquecimiento objetivo con hibridación a 65 ° C dio como resultado resultados mucho mejores para cada patógeno, y en muchos casos se obtuvieron genomas exitosos con este método (Figura 1). 
Para evaluar la selección óptima de muestras para el enriquecimiento objetivo, evaluamos la relación entre los valores de diagnóstico de qPCR Ct y la eficiencia de la recuperación del genoma, medida por el porcentaje de lecturas en el objetivo (%OTR). Esta métrica refleja la proporción de lecturas de secuenciación que se asignan al genoma del organismo objetivo y se usa comúnmente para evaluar el rendimiento del enriquecimiento. Se encontró una correlación significativa entre la carga de patógenos y el éxito de la secuenciación de C. trachomatis, con un punto de corte de Ct para el éxito alrededor de Ct30. Aunque los datos para los otros patógenos objetivo fueron limitados, se observó una tendencia similar, donde el éxito de la secuenciación del genoma ocurrió predominantemente en muestras con carga de patógenos por debajo de Ct30 (Figura 2).
Este experimento con una temperatura de hibridación de 65 °C dio tasas de éxito en la secuenciación del genoma con un enriquecimiento objetivo del 75% al 80% para C. trachomatis, N. gonorrhoeae y T. pallidum, basado en muestras con valores de Ct inferiores a 30. Las tres muestras positivas de M. genitalium tenían valores de Ct de 30-37 y lograron una menor cobertura del genoma y una profundidad de lectura media. Para mejorar estos resultados, experimentamos con la reducción de la temperatura de hibridación, lo que mejora la hibridación debido al bajo contenido de %G+C en el genoma de M. genitalium . Usando temperaturas de hibridación más bajas, como la temperatura ahora recomendada de 62,5 ° C, podemos mejorar la recuperación de los genomas de M. genitalium sin comprometer la recuperación de otros genomas (Figura 3). Estos resultados demuestran que el enriquecimiento de objetivos es un enfoque eficaz para obtener información genómica valiosa de muestras clínicas y se puede adaptar a una amplia gama de genomas, también a través de un diseño basado en paneles.
El análisis filogenético de los genomas de C. trachomatis enriquecidos con éxito mostró que la mayoría de las muestras de Buenos Aires se agrupan dentro del clado L2b del genotipo ompA, lo que sugiere un linaje exitoso con circulación global. El análisis también reveló la presencia de un linaje novedoso y distinto en Argentina, causante de LGV. Las muestras de este clado difieren en aproximadamente 600 SNP de los otros linajes de LGV, y este linaje se propone como ompA-genotipo L4 (Figura 4). En la Tabla complementaria 1 se proporciona una descripción detallada de las muestras utilizadas en la Figura 1, la Figura 2 y la Figura 4.
Estos hallazgos subrayan el valor del enriquecimiento de objetivos en el estudio de la diversidad de patógenos y demuestran un alto grado de éxito en la secuenciación del genoma de muestras clínicas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Figura 1: Enriquecimiento de genomas mediante enriquecimiento de dianas en comparación con la secuenciación metagenómica directa. El porcentaje de lecturas en el objetivo (%OTR), definido como el porcentaje de lecturas de secuenciación que se asignan al genoma del organismo objetivo, muestra el grado de enriquecimiento logrado con el enriquecimiento objetivo. La línea representa la mediana de todos los puntos de datos y el cuadro indica el rango intercuartílico (RIC) del 50%. Los colores de los puntos de datos corresponden a la fuente de la muestra: azul pálido para Argentina y rojo para Suiza. El éxito de la secuenciación del genoma, definido como la cobertura &gt;95% y la profundidad media de lectura &gt;10, se representa con puntos grandes, mientras que el fracaso se indica con puntos pequeños. Tenga en cuenta las diferentes escalas en el eje y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Esta cifra ha sido modificada de10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
Figura 2: Correlación del % de OTR del enriquecimiento de objetivos con los valores de diagnóstico de qPCR Ct. Los colores de los puntos de datos representan la fuente de la muestra: azul pálido para Argentina y rojo para Suiza. El éxito de la secuenciación del genoma, definido como cobertura &gt;95% y profundidad media de lectura &gt;10, se indica con puntos grandes, mientras que el fracaso se representa con puntos pequeños. Tenga en cuenta las diferentes escalas en el eje y. Abreviaturas: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Esta cifra ha sido modificada de10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
Figura 3: Efecto de la temperatura de hibridación en la recuperación de genomas completos en todos los patógenos bacterianos de ITS en diez muestras. El ADN humano en el rango del de las muestras clínicas se enriqueció con concentraciones conocidas de ADN bacteriano objetivo por separado (único) y también en conjunto para representar una muestra con múltiples infecciones (combinado). Se realizaron dos experimentos, cada uno con los cinco patógenos / combinaciones: 0,01% y 0,03% para representar el porcentaje aproximado de ADN de cada microorganismo en relación con el ADN total en la muestra (el ADN restante corresponde al ADN humano). La recuperación de M. genitalium mejora a temperaturas más bajas. C. trachomatis El ADN se enriqueció a baja concentración; experimentos adicionales muestran que las temperaturas no afectaron la recuperación de los genomas de C. trachomatis (datos no mostrados). Abreviaturas: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
Figura 4: Filogenia ajustada por recombinación de cepas de LGV de Argentina. El análisis incluye todos los genomas de LGV disponibles con datos publicados. Los metadatos que se muestran a la derecha de la filogenia incluyen muestras de pacientes duplicadas, análisis bayesiano de la estructura de la población (BAPS; clúster = clado, con el grupo polifilético BAPS 6 que representa la diversidad genética de la población), método de secuenciación del genoma (datos de este estudio), genotipo ompA , país y año, como se indica en la clave en la parte superior izquierda. Los datos faltantes se muestran en blanco. Los nombres del genoma de este estudio se resaltan en azul claro para Argentina y azul oscuro para Finlandia (no se obtienen por enriquecimiento objetivo). Estos colores se utilizan únicamente para distinguir los genomas generados en este estudio. Los valores de arranque de 1000 bootstraps ultrarrápidos se muestran como porcentajes en las ramas principales. Esta cifra se ha modificado de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria 1: Descripción de materiales, reactivos, instrumentos y equipos utilizados en el estudio. La tabla incluye información detallada sobre el nombre comercial, el fabricante y el número de catálogo de los componentes utilizados para la extracción de ADN, la preparación de bibliotecas, el enriquecimiento de objetivos y la secuenciación. También incluye elementos utilizados para ensayos internos de qPCR y procedimientos generales de biología molecular. Se pueden utilizar alternativas equivalentes para los artículos marcados con un asterisco (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

generating-whole-bacterial-genomes-from-clinical-samples-using-target

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular.

Enfoques Forward genéticos en<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

enriquecimiento de ADNg para la secuenciación de NGS es una herramienta fácil y potente para el estudio de mutaciones constitucionales. En este artículo se presenta el procedimiento para analizar de forma sencilla la secuencia completa de 11 genes implicados en la reparación de daños en el ADN.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos para la caracterización de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de amplificación. El método permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y acomoda un número de procesos de análisis de aguas abajo.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

Este protocolo detalla un enfoque integral para el cultivo, la secuenciación y el ensamblaje del genoma híbrido de novo de las bacterias urinarias. Proporciona un procedimiento reproducible para la generación de secuencias completas y circulares del genoma útiles en el estudio de elementos genéticos cromosómicos y extracromosómicos que contribuyen a la colonización urinaria, la patogénesis y la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos.

Ensamblaje híbrido del genoma de novo para la generación de genomas completos de bacterias urinarias utilizando tecnologías de secuenciación de lectura corta y larga

La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.

Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.

La metaproteómica clínica ofrece información sobre el microbioma humano y sus contribuciones a la enfermedad. Aprovechamos el poder computacional de la plataforma Galaxy para desarrollar un flujo de trabajo bioinformático modular que facilita el análisis metaproteómico complejo basado en espectrometría de masas y la caracterización de diversos tipos de muestras clínicas relevantes para estudios de enfermedades.

Un flujo de trabajo de metaproteómica clínica implementado dentro de la plataforma Galaxy Bioinformatics para analizar las interacciones entre el huésped y el microbioma que subyacen a las enfermedades humanas

El estudio actual describe un flujo de trabajo para la secuenciación nanoporosa de plásmidos cuando la secuencia cromosómica ya se conoce o no tiene interés. Un paso inicial de enriquecimiento de ADN plasmidal asegura una profundidad óptima de secuencia plasmidal y maximiza el número de muestras que pueden secuenciarse por celda de flujo.

Secuenciación y ensamblaje de plásmidos de lectura larga utilizando flujos de trabajo basados en secuenciación nanopore

Aprende a generar genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante enriquecimiento de objetivos. Este protocolo permite la vigilancia genómica de patógenos de ITS como Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.

Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos (Video) | JoVE Journal

Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos

Explorar más videos