Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos

Los genomas pueden proporcionar información sobre la ascendencia, la transmisión y las capacidades de un patógeno. En el caso de las bacterias no cultivables, esta información sólo puede obtenerse mediante el enriquecimiento de la diana. La secuenciación de patógenos bacterianos directamente a partir de muestras clínicas es un desafío debido al abrumador ADN humano, la microbiota diversa y las cargas bacterianas extremadamente bajas.

En muchos casos, el cultivo no es una opción, debido al método de muestreo y a las bacterias fastidiosas. Al aplicar esta tecnología a las bacterias de transmisión sexual, descubrimos un nuevo linaje LGV de Chlamydia trachomatis llamado ompA-genotipo L4, y confirmamos la expansión global del linaje LGV dominante, brindando información clave para el diagnóstico molecular y la vigilancia epidemiológica. Este protocolo de enriquecimiento del progreso permite la recuperación completa del genoma a partir de muestras clínicas de ITS diagnosticadas positivas.

Descubrimos que esta técnica supera la secuenciación profunda metagenómica, el agotamiento del ADN del huésped y la secuenciación adaptativa de nanoporos. Estamos investigando las cepas circulantes de estos patógenos en Europa y Argentina. Esto tiene el potencial de informar sobre la transmisión y la administración de antimicrobianos.

Para comenzar, mida la concentración de ADN de los extractos de ADN de muestras clínicas utilizando un método sensible y preciso basado en fluorescencia. Diluya cada muestra de ADN con agua libre de nucleasas a 10 a 200 nanogramos en un volumen final de 17 microlitros en cada tira de tubo de PCR. Agregue 3 microlitros de mezcla maestra de fragmentación a cada pocillo que contenga los 17 microlitros de ADN diluido.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo 20 veces para mezclar bien. Luego, selle la tira del tubo de PCR. Agite la tira a alta velocidad durante 10 segundos y gire brevemente para recoger el contenido.

A continuación, coloque la tira del tubo de PCR en el termociclador e inicie el protocolo preprogramado para la fragmentación y la incubación. A continuación, prepare la mezcla maestra de reparación final y cola de dA como se muestra en la tabla. Agite y gire el tubo como se mostró anteriormente y manténgalo en hielo.

Luego, pipetee 20 microlitros de la mezcla maestra de reparación final y cola de dA en cada pocillo que contenga 50 microlitros de fragmentos de ADN. Selle la tira y el vórtice a alta velocidad durante ocho segundos. Después de girar brevemente la tira, vuelva a colocarla en el termociclador.

Una vez finalizado el programa del termociclador, coloque la tira del tubo de PCR sobre hielo. A continuación, agregue 25 microlitros de mezcla maestra de ligadura a temperatura ambiente, que se preparó con 30 a 45 minutos de anticipación a cada pocillo que contiene los fragmentos de ADN. Agregue 5 microlitros de mezcla de oligo adaptador para bibliotecas etiquetadas con NBQ a cada pocillo.

Vuelva a colocar inmediatamente la tira del tubo de PCR en el termociclador y continúe con el programa. Para comenzar la purificación del ADN, recupere las perlas magnéticas a 4 grados centígrados y déjelas alcanzar la temperatura ambiente antes de usarlas. Luego, agregue 80 microlitros a cada pocillo de muestra.

Coloque la tira del tubo de PCR en el soporte magnético y lave cada pocillo dos veces con 200 microlitros de etanol al 70%. Espere un minuto durante cada lavado y retire con cuidado el etanol sin alterar las perlas magnéticas. Después de mezclar e incubar las perlas con 35 microlitros de agua libre de nucleasas durante cinco minutos, aspire cuidadosamente el sobrenadante aclarado de cada pocillo y transfiéralo a un pocillo correspondiente en una nueva tira de tubo de PCR.

Coloque la nueva tira de tubo de PCR sobre hielo y deseche las perlas magnéticas. Tome la mezcla de reacción de PCR previa a la recaptura preparada y agregue 11 microlitros en cada pocillo de muestra que contenga la biblioteca de ADN purificado. Agregue 5 microlitros de la reparación principal de índice seleccionada a cada reacción y selle la tira del tubo de PCR.

Inicie el programa del termociclador para la amplificación de PCR como se especifica en la tabla para realizar la PCR previa a la captura. Solo agregue la tira del tubo de PCR una vez que el termociclador haya alcanzado los 98 grados centígrados. Después de completar la PCR previa a la captura, realice otra limpieza basada en perlas para purificar la biblioteca.

Incube el producto de PCR con perlas magnéticas. Luego, coloque el tubo de tira de PCR en un dispositivo de separación magnética y espere de 5 a 10 minutos hasta que la solución se aclare. Mientras la tira permanece en el soporte magnético, retire con cuidado y deseche el sobrenadante transparente de cada pocillo.

Luego, eluya el ADN en 15 microlitros de agua libre de nucleasas y mida la concentración de ADN de la biblioteca de ADN purificada. Para la hibridación de muestras, programe el termociclador de acuerdo con el protocolo especificado aquí. Inicie el programa y pause inmediatamente la ejecución.

Diluir de 500 a 1.000 nanogramos de las bibliotecas de ADN preparadas hasta un volumen final de 12 microlitros utilizando agua libre de nucleasas. Después de agitar y centrifugar la mezcla de bloqueadores de oligonucleótidos, agregue 5 microlitros a cada tubo de muestra. Selle la tira del tubo de PCR y colóquela en el termociclador.

Pausa el termociclador cuando llegue al paso tres del protocolo. Agregue 13 microlitros de la mezcla de hibridación de sonda a temperatura ambiente preparada a cada muestra mientras mantiene la tira dentro del termociclador. Pipetea lentamente hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces para mezclar.

Asegúrese de que no haya burbujas de aire y vuelva a colocar la tira en el termociclador. Luego, confirme que todos los tubos estén sellados herméticamente. Para capturar la biblioteca hibridada, transfiera todo el volumen de cada tubo a los tubos correspondientes que contienen 200 microlitros de perlas de estreptavidina prelavadas.

Recoja las perlas de estreptavidina antes de lavarlas con tampón de lavado a temperatura ambiente. Una vez retirada la tira del tubo de PCR del separador magnético, agregue 200 microlitros de tampón de lavado a alta temperatura precalentado a 70 grados Celsius y vuelva a suspender las perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Selle la tira de tubo, haga un vórtice a alta velocidad y gire rápidamente como se demostró anteriormente.

Coloque la tira de tubo sellada en el bloque del termociclador a 70 grados centígrados e incube durante 5 minutos. Transfiera la tira de tubo de PCR del termociclador al separador magnético a temperatura ambiente. Espere un minuto hasta que la solución se aclare.

Luego, retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Luego, agregue 25 microlitros de agua libre de nucleasas a cada tubo que contenga las perlas. Programe el termociclador como se especifica en la tabla que se muestra aquí.

Agregue 25 microlitros de la mezcla de reacción de PCR posterior a la captura preparada a cada tubo de muestra. Mezcle la reacción hasta que la suspensión sea uniforme y selle firmemente la tira del tubo de PCR sin girarla. Coloque la tira de tubo de PCR sellada en el termociclador.

Después de transferir el producto de PCR a un tubo nuevo, agregue 50 microlitros de suspensión de perlas a cada tubo de muestra y realice la limpieza de ADN como se mostró anteriormente. Mida la concentración de ADN del ADN de la biblioteca purificada final utilizando un método de cuantificación basado en fluorescencia. El enriquecimiento de objetivos dio como resultado porcentajes significativamente más altos de lecturas en el objetivo y, por lo tanto, genomas completos en comparación con la secuenciación directa de todos los patógenos probados, incluidos Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum y Mycoplasma Genitalium.

El éxito de la secuenciación del genoma se observó predominantemente en muestras con valores umbral del ciclo de qPCR inferiores a 30 para los cuatro patógenos. Con una clara correlación inversa entre los valores de CT y el porcentaje de lecturas en el objetivo para Chlamydia trachomatis. Utilizando una temperatura de hibridación de 62,5 grados Celsius en comparación con los 65 grados Celsius anteriores, mejoró la cobertura del genoma para Mycoplasma genitalium sin reducir el rendimiento de los otros patógenos objetivo.

El análisis filogenético de los genomas de Chlamydia trachomatis de Argentina mostró muchas muestras agrupadas dentro del clado L2b y reveló un nuevo linaje propuesto como ompA-genotipo L4 separado de todos los genomas LGV anteriores por aproximadamente 600 polimorfismos de nucleótido único.