Cartografía molecular de doble modalidad: integración de la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas

Nos centramos en la biología especial para comprender mejor los mecanismos moleculares del cáncer de ovario con la esperanza de encontrar nuevos objetivos terapéuticos y biomarcadores que predigan la supervivencia del paciente. Uno de los desafíos actuales de la IMC incluye la disección de proteínas de menor abundancia, el trabajo de validación y titulación de anticuerpos, así como la clasificación de píxeles compleja y que consume mucho tiempo durante el análisis. Comienza eliminando el exceso de líquido de las láminas preparadas de FFPE.

Saca la bandeja de control de humedad del horno y coloca el portadeslizadores en la bandeja. Luego, aplica el amplificador de ARN-ISH vórtice 3 a fondo y añade suficiente reactivo para cubrir completamente cada sección de tejido en las láminas. Cierra la bandeja y insértala en el horno de hibridación durante 30 minutos a 40 grados Celsius.

Durante la incubación, prepara la mezcla de oligonucleótidos metálicos diluyendo cada oligo en una proporción de uno a 15. Mezcla bien el ólico metálico y déjalo a temperatura ambiente hasta que se use más. Ahora, quita la bandeja de control de humedad del horno.

Saca el portaobjetos de la bandeja y vuelve a meterla en el horno. Luego, coloca las láminas en un portaobjetos transparente que haya sido prelavado con agua libre de nucleasa. Lava las láminas en el buffer de lavado bajo una ligera agitación durante dos minutos.

Después de retirar el exceso de líquido de las láminas, saca la bandeja de control de humedad del horno y coloca el portaportaobjetos en la bandeja. Añade los oligonucleótidos metálicos mezclados preparados antes para cubrir completamente cada sección de tejido. Ahora, cierra completamente la bandeja y métela en el horno de hibridación durante 45 minutos a 40 grados Celsius.

Retira la bandeja de control de humedad del horno de hibridación, saca el portadeslizadores y vuelve a meter la bandeja vacía en el horno. Para bloquear los sitios de unión inespecíficos, añade un volumen suficiente de tampón bloqueante para cubrir completamente cada sección de tejido del portaobjetos e incuba los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras las láminas están incubadas, prepara la mezcla de anticuerpos diluyendo los anticuerpos usando el tampón diluyente de anticuerpos.

Una vez finalizada la incubación, se elimina el tampón de las láminas de tejido y se dispensa suficiente mezcla de anticuerpos previamente preparada para cubrir completamente las secciones del tejido. Luego, coloca las láminas en una cámara de humedad e incubalas durante la noche a cuatro grados Celsius. Para preparar una solución fresca de intercalador de iridio, realizar una dilución de uno a 2.000 a partir de una solución de stock de 500 micromolares utilizando TBS libre de RNasa.

Coloque las láminas en un portaobjetos transparente que haya sido prelavado con agua sin nucleasa y lave las láminas en el tampón TBS-T con una ligera agitación durante cinco minutos. Luego, para teñir las láminas, añade la solución de trabajo de Iridio preparada y incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de eso, coloca las láminas en un portaportaobjetos transparente que haya sido prelavado con agua libre de nucleasa.

Lava las láminas dos veces en el buffer TBS-T con ligera agitación durante cinco minutos. Luego, sumerge rápidamente las láminas en agua destilada doblemente para evitar la cristalización de la sal por TBS sobre el tejido. Seca las láminas bajo una capucha química durante 10 minutos y guárdalas a cuatro grados Celsius hasta la adquisición de la imagen.

Carga el portaobjetos preparado en la cámara de ablación del sistema de citometría de masas por imagen. Captura una imagen panorámica de la diapositiva para identificar la región de interés. Utilizando el software de adquisición de imágenes, marca las regiones de interés deseadas en la imagen panorámica.

Aplica la plantilla de adquisición en el software de adquisición de imágenes. Y ajusta la potencia del láser según el tipo de muestra. Ahora, empieza el proceso de ablación láser.

Mide la cantidad de cada isótopo usando el detector, que convierte los datos en formato digital para su análisis. El estado de activación de las células T CD8 se evaluó mediante la co-detección de granzyma B tanto a nivel de ARNm como de proteína, junto con la positividad interferón-gamma. Se demostró que un fibroblasto asociado al cáncer expresaba la proteína MFAP5 y el ARNm POSTN, ambos marcadores de la agresividad de fibroblastos asociados al cáncer.

Se demostró que una célula T CD4 coexpresaba ARNm de IL17A e IL6, lo cual coincidía con la identidad de la célula TH17. Se observó que las células T CD4 expresaban ARNm IL13. Se observaron células tumorales CD47positivas a queratina cerca de una célula T CD8.

Se demostró que una célula T CD8 activada expresaba la proteína CD25. Se observó una tinción comparable por ARNm de THBS2 y CD47 entre protocolos conjugados con metales y marcados con fluorescencia.