Name: Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar microARN y proteínas simultáneamente en tejido FFPE mediante hibridación in situ con ácido nucleico bloqueado. Este método preserva la estructura tisular y permite el estudio espacial del microambiente tumoral.

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<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers. 14 (10), 2569(2022).</li>
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<li>Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+exosomal+miRNA+biosensing+for+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy.</a> Molecules. 27 (21), 7145(2022).</li>
<li>Farrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+circulating+miRNAs+in+bovine+serum+and+their+potential+as+novel+biomarkers+of+early+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection.</a> PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).</li>
<li>Aparicio-Puerta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srnabench+and+srnatoolbox+2022+update%3A+Accurate+mirna+and+sncrna+profiling+for+model+and+non-model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms.</a> Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).</li>
<li>Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirdeep2+accurately+identifies+known+and+hundreds+of+novel+microRNA+genes+in+seven+animal+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades.</a> Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).</li>
<li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtarbase+2016%3A+Updates+to+the+experimentally+validated+miRNA-target+interactions+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database.</a> Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+miRNAs+and+gene-specific+mRNA+at+the+single-cell+level+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry.</a> Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).</li>
<li>Eichert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+an+%27all+locked%27+nucleic+acid+duplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex.</a> Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).</li>
<li>Viratham Pulsawatdi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+multiplex+immunofluorescence+and+digital+pathology+workflow+for+the+characterisation+of+the+tumour+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment.</a> Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).</li>
<li>Janati-Idrissi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+a+needle+in+a+haystack%3A+De+novo+phenotypic+target+identification+reveals+hippo+pathway-mediated+mir-202+regulation+of+egg+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production.</a> Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x solución salina con TIS bufferizada (TBS) pH 7,6&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; J62662&nbsp; K7</td><td>Para lavados intermitentes entre pasos</td></tr><tr><td>1x Diluente/Bloqueo de Anticuerpos de Ópalo y nbsp;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1001EA</td><td>Solución bloqueadora de proteínas</td></tr><tr><td>Diluyente de amplificación de automatización 1x Plus</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1609</td><td>Usado para diluir fluoróforos de ópalo</td></tr><tr><td>20x Concentrado&nbsp; Amortiguador de citrato de sodio salino (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td>Para lavados de miARN tras la hibridación con sonda</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific/ Invitrogen</td><td>EN62248 / 62248</td><td>Para tinción nuclear</td></tr><tr><td>Sistema de Hibridación ACD HybEZ II</td><td>ACD Biotechne</td><td>321711</td><td>Horno utilizado para regular la temperatura durante el protocolo miRNAscope</td></tr><tr><td>Anti-CD8 (D8A8Y), conejo mAb</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>85336S</td><td>Ejemplo de anticuerpo primario utilizado para optimizar este protocolo</td></tr><tr><td>Anti-digoxigenina (ratón) Conjugado HRP</td><td>Revvity Health Sciences Inc</td><td>NEF832001EA</td><td>Reactivo secundario utilizado para la detección de miARN</td></tr><tr><td>Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAb</td><td>Tecnologías de señalización celular</td><td>93790</td><td>Ejemplo de anticuerpo primario utilizado para optimizar este protocolo</td></tr><tr><td>Polvo reactivo bloqueante</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1012</td><td>Solución bloqueadora de miARN</td></tr><tr><td>Alcohol etílico 100% (200 grados)</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>Para la deparafinización</td></tr><tr><td>Búfer EZ-AR1</td><td>BioGeneX</td><td>HK521-XAK</td><td>Utilizado para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE en la fase de proteínas</td></tr><tr><td>Amortiguador EZ-AR1 Elegance</td><td>BioGeneX</td><td>HK546-XAK</td><td>Utilizado para la recuperación de antígenos de secciones de tejido FFPE en el paso de la sonda de miARN</td></tr><tr><td>Sistema IR EZ-Retriever</td><td>BioGeneX</td><td>MW015-IR</td><td>Microondas utilizado para la extracción de antígenos de secciones de tejido FFPE</td></tr><tr><td>Solución de Peróxido de Hidrógeno 30%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp;</td><td>HX0640-5&nbsp;</td><td>Para la preparación de tejidos. Ayuda a bloquear la actividad endógena de la peroxidasa y a producir productos muy coloreados</td></tr><tr><td>Sonda de miARN miR-181c-3p</td><td>Qiagen</td><td>339112</td><td>Ejemplo de la sonda de miRNA utilizada para optimizar este protocolo</td></tr><tr><td>Conjunto de Búfer de miARN ISH (FFPE) de LNA miRCURY</td><td>Qiagen</td><td>339450&nbsp;</td><td>Usado para diluir la sonda de miRNA</td></tr><tr><td>Opal 620</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1495001KT</td><td>Fluoróforo para identificar anticuerpos primarios</td></tr><tr><td>Opal 690&nbsp;</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>FP1497001KT</td><td>Fluoróforo para identificar anticuerpos primarios</td></tr><tr><td>Opal Anti-Ms + Rb HRP</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>Anticuerpo secundario utilizado como agente de detección</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehído (w/v), libre de metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Obtener un 3,7% de PFA para la preparación de tejidos</td></tr><tr><td>Antifundido de diamante ProLong</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Medios de montaje</td></tr><tr><td>RNAscope Proteasa Plus</td><td>ACD Biotechne</td><td>322331</td><td>Para permeabilizar secciones tisulares &nbsp; digiriendo parcialmente proteínas y exponer moléculas de miARN objetivo</td></tr><tr><td>Agua libre de ARN y nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CM&nbsp;</td><td>Limpiar y preparar todo el equipo, y usarlo como diluyente cuando sea necesario... &nbsp;</td></tr><tr><td>Preadolescentes 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td>Para crear TBS-T</td></tr><tr><td>Amplificación de señal de tiramida más cianina 3</td><td>Akoya Biosciences&nbsp;</td><td>NEL744001KT</td><td>Fluoróforo para identificar miARN</td></tr><tr><td>Sondas de miARN U6 y Scramble</td><td>Qiagen</td><td>339459</td><td>Sondas de control opcionales</td></tr><tr><td>Grado histológico de xilenos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1307</td><td>Para la deparafinización</td></tr></tbody></table>

amplificación y reconocimiento de microarn a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

MicroRNA Amplification and Recognition through Locked-nucleic-acid In situ Hybridization as a Novel Detection and Quantification Method

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

When using traditional probe-based in situ hybridization (ISH) imaging detection methods, microRNAs (miRNAs) are difficult to capture due to their size, ...

microrna-amplification-recognition-through-locked-nucleic-acid-situ

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Una novela de alto rendimiento se describe el método que permite la detección y cuantificación relativa de los pequeños ARN y la expresión del ARNm de las células bacterianas individuales usando sondas de ácido nucleico cerrado y citometría de flujo...

Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ</emHibridación> (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN

Este video describe una estrategia de hibridación secuencial que implica la hibridación de sondas de ARNm con ARNm objetivo específico. Después de la hibridación de la sonda, se realiza una amplificación de la señal para mejorar la resolución a través de la reducción de la relación señal-ruido durante el ARN-CISH de las muestras histológicas.

Hibridación de sonda y amplificación de señal en ARN Hibridación in situ: una técnica para detectar secuencias específicas de ARN en secciones de tejido

El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en Drosophila melanogaster

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Aquí presentamos un protocolo para detectar la expresión de miRNA en muestras de pacientes con cáncer de mama utilizando hibridación in situ de miRNA.

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.

Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

Reproducible, contar los números de los mRNAs de los ovocitos, in situ de la fluorescencia de una molécula de RNA hibridación (RNA-pescado) fue optimizado para las células no adherentes. Ovocitos se recolectaron, cruzado por hibridación con las sondas específicas de transcripción y cuantificaron utilizando un software de cuantificación de la imagen.

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Este método demuestra el uso de la técnica de hibridación del norte para detectar miRNAs a partir del extracto total de ARN.

Análisis de manchas de ARN para la detección y cuantificación de microARN de plantas

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Aprende a detectar y cuantificar microARN y proteínas simultáneamente en tejido FFPE mediante hibridación in situ con ácido nucleico bloqueado. Este método preserva la estructura tisular y permite el estudio espacial del microambiente tumoral.

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