Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Las inyecciones subretinianas son una herramienta importante para las investigaciones preclínicas de terapias para enfermedades hereditarias de la retina. En este video, presentamos una técnica de inyección subretiniana optimizada y mínimamente invasiva en ratones. Las inyecciones subretinianas transesclerales son una excelente manera de administrar material a los fotorreceptores y al EPR.

Sin embargo, esta técnica es técnicamente desafiante y requiere desarrollar un protocolo optimizado para aumentar su reproducibilidad y accesibilidad. Nuestras mejoras incluyen el desarrollo de un espéculo palpebral de ratón, la administración preoperatoria de atropina, la creación de una esclerotomía milimétrica con un cuchillo de diamante y la optimización del tamaño de la aguja y el enfoque de inyección. Esperamos que la consistencia, la reproducibilidad, la excelente cobertura de transducción y el daño quirúrgico mínimo de nuestro método mejoren la accesibilidad de las inyecciones subretinianas para la comunidad científica.

Nuestras optimizaciones facilitan y agilizan la realización de inyecciones subretinianas en ratones, reducen la variabilidad experimental y mejoran las tasas de éxito de las inyecciones. Esta técnica facilitará la futura investigación traslacional preclínica de la retina. Para comenzar, administre un miligramo por kilogramo de atropina intraperitoneal en un volumen total de 50 microlitros 30 minutos antes de realizar la inyección subretiniana.

Cargue una microaguja de vidrio con el volumen deseado de la solución inyectable. Conecte la aguja al microinyector y ajuste la presión de compensación a cinco hectopascales para contrarrestar la acción capilar. Coloque el ratón anestesiado bajo un microscopio estereoscópico de disección.

Aplique una gota de proparacaína al 0,5% en el ojo para lograr la anestesia tópica. Aplique una gota de una mezcla que contenga ciclopentolato al 0,2% y fenilefrina al 1% en el ojo para dilatar la pupila para obtener imágenes postoperatorias de la ampolla subretiniana y reducir el sangrado intraoperatorio. Usando un espéculo de alambre en miniatura personalizado, exponga el fórnix superior e inmovilice el espéculo para permitir la retracción del párpado superior con manos libres.

Con unas tijeras Vannas en ángulo, haga un par de incisiones limbales aproximadamente un milímetro posterior al limbo en la conjuntiva superior y la cápsula de Tenon para exponer la esclerótica superior. Retire con cuidado cualquier resto de la cápsula de Tenon sobre el lugar de la inyección. Ahora agarre el borde anterior de la peritomía conjuntival y la tenotomía con pinzas dentadas de bloqueo.

Luego inferoducto suavemente el globo para exponer la esclerótica superior. Aplicar inmediatamente una gota de solución salina tamponada equilibrada en el ojo para mantener hidratada la esclerótica desnuda y lograr un mayor aumento óptico. Con un cuchillo de diamante, realice una esclerotomía puntual aproximadamente a las 12 en punto y a uno o dos milímetros del limbo.

Colocar la cuchilla tangencialmente a la esclerótica para garantizar que la esclerotomía sea pequeña y poco profunda. Use una esponja quirúrgica para eliminar suavemente toda la solución salina tamponada equilibrada de la superficie del ojo. Sostenga el bisel de la aguja hacia abajo en un ángulo poco profundo con respecto a la esclerótica e inserte lentamente la punta en la esclerotomía, avanzando solo de 0,5 a un milímetro para acceder al espacio subretiniano sin penetrar en la retina.

Mientras sostiene la aguja firmemente, inicie la inyección a 500 hectopascales usando el pedal y mantenga una presión continua durante 15 segundos. Retire la aguja y observe un reflujo parcial de la solución inyectada a través del sitio de la esclerotomía, lo que indica un parto exitoso ya que el espacio subretiniano no puede acomodar el volumen completo de la solución inyectada. Retire con cuidado las pinzas de bloqueo y el espéculo del párpado sin aplicar presión sobre el globo para evitar un reflujo adicional.

Inmediatamente después de la inyección, aplique una cantidad generosa de ungüento lubricante para los ojos para ayudar con la visualización de la ampolla subretiniana. Una ampolla subretiniana fue claramente visible en la OCT inmediatamente después de la inyección transcleral, lo que confirmó un parto exitoso. Para evaluar el epitelio pigmentario de la retina, o EPR, se inyectó la distrofina AAV-8 1-GFP, lo que resultó en una fluorescencia verde generalizada en toda la capa del epitelio, lo que indica una transducción de EPR eficiente y amplia utilizando el enfoque transcleral.

AAV-8 rodopsina GFP condujo a una fuerte señal fluorescente verde en los fotorreceptores de bastones, visible tanto en secciones transversales como en vistas de fondo de ojo, lo que indica una orientación y expresión exitosas en células fotorreceptoras. AAV8-CAG-mCherry produjo una amplia fluorescencia roja en las capas de la retina, lo que demuestra la capacidad de esta técnica para apoyar la expresión generalizada de transgenes más allá de tipos específicos de células. La transferencia Western de lisados de retina también mostró una fuerte expresión de proteína fluorescente verde con los niveles más altos correspondientes al centro de la ampolla de inyección, validando la transducción de fotorreceptores con AAV8 rodopsina GFP.

La optimización del título de AAV mediante el análisis de inmunofluorescencia de secciones de retina permite la selección del título viral que logra la transducción de aproximadamente el 90% de las células diana. Por ejemplo, en este caso, una dilución de uno a 10 de un stock viral de rodopsina GFP AAV8 produjo expresión transgénica en casi todos los fotorreceptores. Por el contrario, una dilución de uno a 100 resultó en una tasa de transducción insuficiente.

El electrorretinograma mostró que las inyecciones transesclerales preservaron la función retiniana normal, mientras que las inyecciones transretinianas condujeron a una reducción significativa de las respuestas de la onda A y la onda B, lo que indica daño retiniano.