Determinación estructural de hemaglutinina con resolución subnanométrica a partir de tomografía crioelectrónica de virus de influenza

Nuestro laboratorio utiliza biología estructural para estudiar virus y la evolución de la resistencia a los fármacos. En el trabajo actual, estamos caracterizando cómo la hemaglutinina de la gripe cambia la conformación al unirse a los receptores. Hemos utilizado la criotomografía electrónica para visualizar la morfología, la organización y estructura viral.

Específicamente, hemos utilizado esta modalidad de criomicroscopía electrónica para obtener imágenes del virus pleomórfico de la gripe. Nuestro protocolo nos permite estudiar la organización y estructura de la hemaglutinina de la gripe in situ en virus intactos con resolución subnanométrica. Esta mayor resolución nos permite visualizar interacciones que antes estaban ocultas.

Para empezar, lanza un terminal Linux para activar el entorno Conda. Usa el terminal para activar el entorno Conda con ISO net instalado. Crea una subcarpeta llamada carpeta tomo y luego mueve todos los archivos tomogram a esa carpeta.

Después, usa el código para generar un archivo estrella en la carpeta del proyecto. Usando un editor de texto, abre el archivo estrella generado e introduce el valor aproximado de desenfoque de las imágenes con inclinación de cero grados en la cuarta columna. Ahora ejecuta el comando de convolución CTFD en el terminal.

Tras desconvolver, activa el entorno de la interfaz gráfica EMAN2 para comenzar el preprocesamiento de la selección de partículas. En tomografía, haz clic izquierdo en la flecha junto a datos en bruto, selecciona importar tomografías en el menú desplegable y elige los archivos. Luego, haz clic izquierdo en la flecha junto a segmentación y elige tomogramas preprocesados.

Utiliza parámetros predeterminados adecuados. Tras el preprocesado, se creará automáticamente un directorio de información con archivos JSON en blanco que coincidan con los nombres base de los archivos tomografías de proceso. Añade la información de los píxeles angstrom a los archivos antes de continuar.

Para entrenar una red neuronal convolucional, o CNN, para reconocer la glicoproteína HA, cambia el directorio de trabajo a la ubicación de los tomogramas que se van a utilizar. Luego abre la interfaz de entrenamiento de CNN usando el terminal. Confirma que cuatro ventanas están abiertas.

Una contenía la información sobre los parámetros de la CNN y tomogramas en el directorio, y las otras tres ventanas contenían imágenes de buenas referencias, malas referencias y partículas seleccionadas por la CNN. En la interfaz gráfica de CNN, haz clic en la nueva opción para inicializar una CNN con una tasa de aprendizaje predeterminada de 0,0001 y un tamaño de caja de ocho. En la columna de nombre del archivo, haz clic izquierdo en un tomograma representativo para abrirlo.

Pasa el cursor sobre el tomograma abierto y haz clic en la rueda del ratón para abrir una nueva ventana. Haz clic izquierdo en el deslizador del número N para recorrer el eje Z. A continuación, en el tomograma abierto, utiliza el panel de buenas referencias para seleccionar entre 10 y 20 características correspondientes al HA. Las imágenes positivas aparecen en la ventana positiva.

Para eliminar uno, mantén pulsado shift y haz clic izquierdo. Ahora cambia al panel de referencias defectuosas y selecciona entre 10 y 20 referencias correspondientes a características como parches de membrana vacíos, la densidad RNP, marcadores fiduciales y restos. Configura el número de iteraciones a 50 y haz clic en el icono del tren para comenzar la formación CNN.

Una vez terminada la formación, pulsa aplicar. Las partículas seleccionadas se mostrarán en el tomograma como círculos azules o pueden verse en la ventana de partículas. Sigue refinando seleccionando referencias positivas y negativas adicionales, haciendo clic periódicamente en guardar para preservar el progreso.

Una vez que el CNN funcione satisfactoriamente, haz clic en aplicar todo para ejecutar la selección de partículas. Luego evalúa los resultados de varias tomografías y reentrena según sea necesario. Para guardar las coordenadas de cada tomograma, reabre la interfaz gráfica de EMAN2 usando el comando e2projectmanager.py.

Haz clic en la flecha debajo de la media de subtomogramas y selecciona boxeo manual. Ahora, introduce el nombre del tomograma y haz clic en lanzar. Luego, haz clic secuencialmente en archivo, guarda el cable de la caja y tomogram_ha.

Envíe un mensaje para guardar las coordenadas. Navega a la subcarpeta de red neuronal y a la subcarpeta de información para hacer copia de seguridad y guardar en red. HDF, salidas de trenes.

HDF, segmentos. hdf, y boxes3Dref.hdf. Entrena un segundo CNN para detectar la capa de proteína M1 y la presencia de VRNP cambiando el tamaño de la caja de entrenamiento de ocho a catorce.

Para seleccionar partículas, primero descarga los cuadernos del repositorio de GitHub. Luego abre el cuaderno de limpieza de partículas CNN y carga los módulos necesarios. Carga los archivos de texto de coordenadas HA y M1 en el cuaderno.

Míralos como nubes 3D usando la biblioteca 3D abierta. A continuación, filtra los valores atípicos de coordenadas HA usando un método abierto de eliminación de valores atípicos estadísticos 3D. A continuación, calcula las distancias entre nubes de puntos HA y M1 identificando puntos HA a más de 20 píxeles de M1 como valores atípicos y guarda las coordenadas restantes en un archivo de texto de salida.

Concatena todas las partículas y guarda como archivos estrella usando el archivo estrella pts2. IPYNB. Usando WarpTools, extrae partículas que doblan el factor cuatro y realiza el promedio inicial de subtomogramas en RELION menos cuatro usando el código. Convierte el archivo de estrella de teletransporte al formato RELION 4.

Luego genera una referencia inicial usando RELION refine MPI sobre un subconjunto de partículas. Realiza refinamiento automático 3D en subtomogramas con RELION refine MPI. Al converger, repite el refinamiento automático con desplazamiento de titán a ocho y paso a dos.

Aprovecha la clasificación 2D para descartar partículas basura usando el refinamiento RELLION. Crea archivos estrella con buenas clases usando el código, luego combina los archivos estrella individuales. Tomografías representativas revelaron viriones pleomórficos con formas que iban desde esféricas hasta alargadas.

El promedio final del subtomograma alcanzó una resolución global de 6,0 angstroms con una resolución local que oscilaba entre cinco y siete angstroms. Las hélices alfa y las láminas beta se resolvieron en la reconstrucción final de AH, apoyando la calidad estructural del mapa refinado. Se identificaron sitios de glicosilación en cuatro posiciones de la cabeza y el tallo de AH, lo que confirmó la visibilidad de la densidad de glicanos en la reconstrucción final.