Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

Nuestra investigación actual se centra en comprender la enfermedad del cáncer de pulmón y cómo desarrollar nuevas modalidades de tratamiento compatibles con la terapia estándar de atención, incluyendo quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia. No pudimos encontrar un modelo ortotópico de cáncer de pulmón que estableciera criterios específicos para estudiar el cáncer de pulmón en fase temprana. Trabajamos para proporcionar directrices claras y replicables que cubran esa carencia con este protocolo.

Este protocolo es mínimamente invasivo y sencillo de ejecutar. Además, con los criterios que hemos proporcionado, este protocolo permite el cribado de implantación tumoral precisa y facilita la detección temprana mediante imagen bioluminiscente. Este protocolo permite a los investigadores estudiar el cáncer de pulmón en estadio temprano en el tejido huésped, facilitando el avance preclínico de nuevas terapias oncoológicas y la investigación del microambiente tumoral.

Utilizaremos esta técnica para evaluar los mecanismos y la eficacia de nuevos y emocionantes tratamientos contra el cáncer de pulmón de forma preclínica y esperamos que pueda conducir a una atención futura al paciente. Para empezar, coloca al ratón anestesiado en un cono nasal, en posición prona sobre un dispositivo de calentamiento, y aplica ungüento oftálmico en ambos ojos del ratón. Una vez confirmada la anestesia, utiliza una máquina eléctrica para eliminar el pelo de una zona rectangular de dos por tres centímetros en el lado dorsal izquierdo del ratón.

Afeitarse desde la columna medialmente, la mesa lateralmente, la última costilla hacia abajo y el borde superior de la escápula hacia la cabeza hasta que no se vea pelo. Coloca al ratón en una jaula vacía sobre un dispositivo de calentamiento. Observa el patrón de respiración hasta que el ratón recupere la alerta y luego devuélvelo a su jaula hasta la cirugía.

El día de la extracción celular, añade un medio fresco que contenga 50 miligramos por mililitro de gentamicina a la placa de cultivo tres o cuatro horas antes de la recogida. Aspira el medio desde la placa de cultivo y lava las células unidas con 1x PBS. Luego incuba las células con solución de tripsina EDTA durante uno o dos minutos a 37 grados Celsius.

Añade medios frescos para neutralizar la tripsina. Dispersa las células golpeando suavemente o pipeteando la placa. Luego recoge la suspensión de la celda en un tubo cónico de 50 mililitros.

Ahora, centrifuga el tubo cónico a 1.200 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Tras confirmar la presencia de un pellet compacto en el fondo, aspira el sobrenadante y lava el pellet con PBS. Resuspende el pellet de células lavado en PBS para alcanzar una concentración de aproximadamente uno a dos millones de células por mililitro para el contar.

Filtra la suspensión a través de un colador de celda de 40 micrómetros antes de continuar. A continuación, combina 10 microlitros de la suspensión de celda con 10 microlitros de azul de tripán. Carga la muestra teñida en un hemocitómetro y cuenta las células.

Calcula el número total de celdas y la viabilidad de las celdas. Centrifugar las celdas de nuevo a 1.200 g durante tres minutos a temperatura ambiente y aspirar el PBS que sale del pellet. Resuspende el pellet celular en 0,5 miligramos por mililitro de gel de metra en PBS.

Ajusta al número de células deseado en un volumen total de inyección de 50 microlitros. Mantén la suspensión de la celda sobre hielo para evitar la solidificación del matrigel. Limpia el lugar quirúrgico del animal anestesiado tres veces con gasas estériles, alternando entre Betadine y etanol al 70%.

Coloca una cortina quirúrgica esterilizada con ventanas con una abertura de tres por cuatro centímetros sobre el ratón y coloca instrumentos quirúrgicos de autoclave sobre la cortina. Con pinzas, identifica el borde craneal de la escápula y el borde de mimido de la caja torácica. Con la piel tensa entre el pulgar y el índice del cirujano, realiza una incisión superficial de cinco milímetros justo debajo de la escápula usando una hoja de bisturí tamaño 10.

Luego usa tijeras rectas de 115 milímetros para diseccionar la grasa subcutánea de las costillas y los músculos intercostales sin atravesarlas. Para detener cualquier sangrado leve causado por daño capilar, presiona suavemente un aplicador esterilizado con punta de algodón sobre la zona sangrante. Sujeta la incisión abierta usando microanuncios y pinzas.

Comenzando en la séptima costilla verdadera, utiliza pinzas curvas medianas para contar hacia arriba y localizar la cuarta y quinta costilla. Marca esta región como el lugar de inyección. Ahora, invierte suavemente el tubo de suspensión de la celda tres o cuatro veces para mezclarlo.

Justo antes de la inyección, extrae 50 microlitros de la suspensión en una jeringuilla estéril de insulina de ocho milímetros de 300 microlitros y 31 calibres, asegurándose de que no haya burbujas. Coloca una tira de cinta metálica esterilizada de cuatro milímetros de grosor enjuagada a la jeringuilla para actuar como tapón y controlar la profundidad de inyección. Inyecta la suspensión de celdas de 50 microlitros en un ángulo de 90 grados en el espacio intercostal entre las costillas cuatro y cinco justo debajo de la cuarta costilla, y mantén la aguja en posición durante dos o tres segundos.

Retira lentamente la aguja en el mismo ángulo que la insertó y deséchala en un recipiente para objetos punzantes. Finalmente, cierra la incisión cutánea usando dos o tres puntos cuadrados con nudos y aplica adhesivo quirúrgico veterinario sobre las suturas para reforzar el cierre de la herida. La imagen bioluminiscencia detectó señales asociadas al tumor en ratones experimentales tan pronto como un día después de la inyección y la radiancia aumentó visiblemente con el tiempo tanto en 25.000 como en 50.000 células por grupo de ratón, observándose una mayor intensidad en el grupo de 50.000 células.

El flujo tumoral total aumentó exponencialmente tanto en los grupos celulares 25.000 como en los 50.000, alcanzando más de 10 veces 10 a la potencia de ocho fotones por segundo al día 21 en el grupo de 50.000 células. Los ratones simulados no mostraron luminiscencia ni tumor visible en pulmones diseccionados, mientras que los experimentales mostraron alta luminiscencia y masas tumorales rojas en el tejido pulmonar. A los 21 días tras la inyección, los ratones incluidos mostraron tumores confinados al lóbulo pulmonar izquierdo sin invasión en las regiones circundantes.