Uso de microperfusión cerebral de flujo abierto para la recogida longitudinal de fluido intersticial en un modelo animal de glioblastoma

Estamos caracterizando componentes solubles de señalización dentro del líquido intersticial del tumor cerebral que contribuyen a la progresión de la enfermedad y a la respuesta al tratamiento. Evaluar las concentraciones absolutas de soluto en el intersticial tumor cerebral sigue siendo un reto investigativo que requiere el uso de métodos experimentales sofisticados. Para empezar, con un bisturí estéril, realiza una incisión sagital en la línea media a lo largo de la superficie del cráneo, comenzando entre los ojos y extendiéndose caudal durante 8 a 10 milímetros.

Luego usa pinzas estériles para retraer lateralmente la piel desde la incisión mediana. Asegúrate de que tanto bregma como lambda sean visibles y extiende la incisión si es necesario. A continuación, con un bisturí estéril, incise el periosteo y retrae el tejido lateralmente con pinzas.

Aplica peróxido de hidrógeno del 1% al 3% con un aplicador estéril con punta de algodón para limpiar la superficie del cráneo. Ahora utiliza una jeringuilla de insulina de 0,3 a 1,0 mililitros para aplicar de forma uniforme entre 20 y 40 microlitros de adhesivo dental autograbante sobre la superficie del cráneo. Luego exponlo a una luz de curado dental para grabar el adhesivo.

Una vez curado, elimina el exceso de adhesivo con aplicadores estériles de punta de algodón y solución salina. Reposiciona la broca a la coordenada guía cOFM. Ajusta el taladro a 15.000 revoluciones por minuto y haz un agujero de rebala usando la esfera del micromanipulador DV.

Monitoriza frecuentemente el grosor del cráneo durante la perforación y enjuague con solución fisiológica para eliminar residuos y reducir el calor. Repite el procedimiento de perforación en cada coordenada de tornillo de anclaje. Ahora instala tornillos de anclaje usando pinzas estériles y un destornillador estéril hasta insertar una o dos roscas de profundidad.

Luego monta la guía cOFM y el conjunto ficticio en el portaguías y fija el soporte al marco estereotáxico. Coloca la punta guía sobre el agujero de la muela y bájala lentamente hasta la profundidad predeterminada a 1 milímetro por minuto. Aplica el agente cementante al cráneo en capas finas y uniformes, cubriendo las zonas debajo y alrededor de la guía y los tornillos del cOFM.

Utiliza una luz de curado dental para endurecer cada capa antes de aplicar la siguiente. Asegúrate de que el cemento cubra toda la zona entre los componentes evitando la cuña de bloqueo. Desconecta el soporte de la guía cOFM y levántalo lentamente usando el mando DV del micromanipulador.

Usando pinzas, retira la cuña de bloqueo de la guía y el conjunto ficticio del cOFM. Levanta suavemente el maniquí de la guía. Utiliza los botones micromanipuladores ML y AP para alinear el conjunto del inserto de infusión de la jeringuilla sobre la guía cOFM.

Baja el inserto de infusión usando el pomo DV y fíjalo en su posición reinsertando firmemente la cuña de bloqueo con pinzas. Ahora inyecta 3 microlitros de suspensión celular desde la jeringuilla a 1 microlitro por minuto. Vigila el área alrededor de la guía cOFM para asegurarte de que no haya ningún flujo de suspensión de celdas fuera del conjunto.

Usa pinzas para quitar la cuña de bloqueo del conjunto de guía y inserto de infusión. Luego levanta cuidadosamente el inserto de infusión de la guía usando el mando de ajuste DV. Prellena las líneas de los tubos de empuje y tirón con líquido cefalorraquídeo artificial usando jeringuillas de vidrio herméticas.

Instala la sección peristáltica del tubo en la cabeza de la bomba de microperfusión. Conecta la bolsa de perfusado al tubo de empuje usando un conector Luer lock. Luego conecta el inserto de muestreo al tubo usando conectores con brida.

Conecta el eje de entrada más largo al extremo de salida del tubo de empuje y el eje de salida más corto al extremo de entrada del tubo de pull. Coloque el inserto de muestreo conectado en un tubo estéril de microcentrífuga que contiene 750 microlitros de líquido cefalorraquídeo artificial. Conecta la aguja del colector de fracciones a la línea de salida del tubo de tracción usando un conector de tubo con brida.

Luego realiza un lavado de tubo durante 20 minutos a 10 microlitros por minuto para eliminar las burbujas de aire. A continuación, prellena la línea de la tubería de extracción con líquido cefalorraquídeo artificial usando jeringuillas herméticas. Reinstala el tubo peristáltico en la cabeza de la bomba de microperfusión.

Conecta de nuevo el inserto de muestreo usando conectores de tubo con brida. Conecta la entrada al extremo de salida del tubo de tracción y la salida al extremo de entrada del tubo de tirada. Coloque el inserto en un tubo estéril de microcentrífuga con 750 microlitros de líquido cefalorraquídeo artificial.

Realiza otro lavado de 20 minutos con el sistema de tubos a 10 microlitros por minuto para eliminar cualquier burbuja de aire residual. Coloca a un animal anestesiado en una chaqueta del tamaño adecuado. Pasa completamente las extremidades delanteras por las sisas y abrocha la chaqueta firmemente a lo largo de la espalda del animal.

Usa un par de pinzas para quitar la cuña de bloqueo del conjunto de guía y dummy. Luego levanta con cuidado el inserto de dummy de la guía. Instala suavemente el inserto de muestreo en la guía y vuelve a insertar la cuña de bloqueo.

Saca al animal de la anestesia y colócalo en el sistema de jaula giratoria. Sujeta el anclaje de la jaula a la chaqueta del animal y activa el sistema de jaula giratoria. Tras el muestreo de cOFM, desactiva el sistema de jaula giratoria y desconecta el amarre de la jaula de la chaqueta animal.

Ahora usa pinzas para quitar la cuña de bloqueo del conjunto guía y del inserto de muestreo. Levanta con cuidado el inserto de muestreo fuera de la guía, luego inserta suavemente el inserto ficticio de nuevo en la guía y vuelve a insertar la cuña de bloqueo. Desengancha los cierres de la parte trasera de la chaqueta del animal y quítala suavemente de la chaqueta del animal.

La imagen bioluminiscente confirmó la presencia de tumores en animales con injerto celular tumoral mediado por cOFM. El análisis proteómico de componentes principales del fluido intersticial muestreado con cOFM reveló una separación clara entre grupos animales tratados con temozolomida y tratados con sulfóxido de dimetilo. Las distribuciones globales de señales metabolómicas se solaparon casi perfectamente entre las muestras de temozolomida y dimetilsulfóxido.

A pesar de la superposición de señales, el análisis metabolómico de volcanes reveló un cambio claramente impulsado por la temozolomida. Las comparaciones cuantitativas de valores metabolómicos de los mismos animales mostraron que las configuraciones recirculadas mejoraban las concentraciones de analitos mientras se preservaban las proporciones relativas de metabolitos. La disponibilidad relativa de nutrientes en el microambiente tumoral cerebral sigue siendo poco comprendida.

Este protocolo se está utilizando para cubrir esta brecha. Caracterizar la disponibilidad y la señalización de nutrientes dentro del microambiente tumoral puede dilucidar los mecanismos de progresión del glioma y resistencia adaptativa al tratamiento.