Evaluación de intervenciones terapéuticas en el modelo de ratón deficiente en SHIP de ileítis y fibrosis similares a la enfermedad de Crohn

Utilizamos ratones deficientes en SHIP para estudiar los mecanismos que impulsan la inflamación intestinal y la fibrosis en la enfermedad de Crohn y para evaluar nuevos fármacos o estrategias terapéuticas para tratar la enfermedad de Crohn. Por eso hemos utilizado este modelo en estudios preclínicos para demostrar la eficacia de fármacos para la EII de glucógeno en la administración dirigida de fármacos. Nuestro protocolo utiliza ratones deficientes en SHIP, que desarrollan naturalmente inflamación ileal y fibrosis, proporcionando un modelo fisiológicamente más relevante que los modelos tradicionales inducidos químicamente o basados en lesiones.

Nuestros hallazgos establecen a los ratones deficientes en SHIP como un modelo robusto de inflamación y fibrosis ileal, permitiendo estudios mecanicistas y pruebas preclínicas de terapias para la enfermedad de Crohn. Para empezar, ayuno a los ratones durante cuatro horas antes de realizar el ensayo. Disolver cuatro kilodaltón de FITC-dextrán en PBS estéril para alcanzar una concentración final de 80 miligramos por mililitro.

A continuación, sujeta suavemente a cada ratón y administra 150 microlitros de la solución de FITC-dextrán mediante un gavage oral, y luego mantén a los ratones sin comida durante otras cuatro horas después del gavage. Después de eutanasiar al ratón, realiza una punción cardíaca usando una aguja calibre 25 y una jeringuilla de un mililitro para recoger sangre. Añadir inmediatamente 10 microlitros de solución ácido-citrato-dextrosa por cada 100 microlitros de sangre recogida como anticoagulante.

Mezcla bien invertiendo el tubo varias veces. Centrifugar las muestras de sangre recogidas a 1.500 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiere cuidadosamente el plasma a tubos microcentrífugas de 1,7 mililitros etiquetados.

Mantén todas las muestras en hielo y protegidas de la luz hasta que estén listas para su análisis. Ahora, diluye cada muestra de plasma en proporciones de uno a dos y de uno a diez usando PBS. Añade 100 microlitros de cada dilución de plasma en una placa opaca de 96 pozos, colocándolos en pozos duplicados.

Realizar una o dos diluciones en serie del material original de 80 miligramos por mililitro de FITC-dextrán utilizando PBS para preparar diferentes concentraciones de la solución. Añadir 100 microlitros de cada dilución en pozos duplicados de la placa de 96 pozos. Luego, se mide la fluorescencia usando un lector de microplacas ajustado a 485 nanómetros para excitación y 535 nanómetros para emisión.

Tras la extracción de sangre Para el ensayo FITC-dextrán, extirpe cuidadosamente todo el intestino delgado del ratón. Retira suavemente cualquier grasa y tejido conectivo adherido del intestino. Coloca el intestino limpio plano sobre una hoja de papel blanco en blanco para mejorar el contraste visual.

Examina el tejido visualmente en busca de signos macroscópicos de enfermedad, prestando especial atención a los 10 centímetros distales en ratones knockout SHIP, donde la inflamación es común. Alinea el intestino junto a una regla para proporcionar escala y fotografía de todo el ejemplar para documentar cualquier hallazgo patológico grave. Enjuaga suavemente la luz intestinal con PBS usando una jeringuilla para eliminar cualquier contenido intestinal, evitando la fuerza excesiva para evitar la distorsión de la vellosidad y la arquitectura criptográfica.

Identificar la región del íleon distal más representativa de la patología macroscópica y excisar aproximadamente un centímetro de tejido. Coloca el tejido extirpado plano dentro de un casete histológico y colócalo entre dos esponjas para evitar pliegues durante la fijación. Para la tinción de hematoxilina y eosina y la tinción tricroma de Masson, fija el tejido en formalina tamponada al 10% de neutralidad usando entre 10 y 20 veces el volumen tisular durante la noche a cuatro grados Celsius.

Tras la fijación, transfiere los casetes al 70% de etanol para su almacenamiento y asegúrate de que permanezcan completamente sumergidos hasta el procesamiento. Para la tinción periódica de azul alciano y ácido-Schiff, fija el tejido en la solución de Carnoy durante la noche a cuatro grados Celsius. Tras la fijación, transfiere los casetes al 100% de etanol para almacenarlos hasta el procesamiento.

Luego, se incrustan los tejidos fijos en parafina y se seccionan en rodajas de cinco micrómetros para teñirlos posteriormente. Puntuar las secciones ileales teñidas con hematoxilina y eosina utilizando una escala de 16 puntos según criterios histopatológicos definidos. Evalúa las secciones transversales teñidas tricromo de Masson utilizando una escala de seis puntos basada en criterios predefinidos.

Calcular la puntuación final de fibrosis como la mediana de las puntuaciones asignadas por dos revisores independientes que están ciegos ante las condiciones experimentales. Tras la disección y extracción de la muestra histológica, se recoge la porción restante de los 10 centímetros distales del íleon. Seca el tejido recogido con una toallita de papel o toallita sin pelusa, y luego registra el peso del tejido usando una báscula calibrada.

Congela rápidamente el tejido en nitrógeno líquido antes de almacenarlo a menos 80 grados Celsius para su posterior procesamiento. Cuando esté listo para el procesamiento, retira el tejido congelado y mantenlo siempre sobre hielo. Luego, pesa de nuevo las muestras de tejido para confirmar la masa precisa.

Preparar el tampón de homogeneización añadiendo inhibidor de proteasa al PBS. Usa 10 microlitros de tampón por miligramo de tejido. Utilizando un homogeneizador de bancada, homogeneiza el tejido ileal de espesor completo en un tampón de homogeneización helado.

Continúa hasta que el homogeneado sea uniforme y libre de fragmentos de tejido visible. Enjuaga bien la punta del homogeneizador con PBS entre muestras para evitar la contaminación cruzada. Centrifugar el tejido homogenea a 10.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Alocuota los supernadantes clarificados en volúmenes más pequeños para evitar ciclos de congelación y descongelación, y luego guárdalos a menos 80 grados Celsius para análisis futuros. El análisis histológico reveló un daño intestinal significativamente mayor en ratones con deficiencia de SHIP en comparación con los controles de SHIP. El tratamiento con dexametasona redujo el daño histológico en ratones deficientes en SHIP, aunque la disminución no fue estadísticamente significativa.

La tinción tricroma de Masson mostró un aumento significativo en la deposición de colágeno en ratones deficientes en SHIP en comparación con los controles de SHIP, lo que indica puntuaciones más altas de fibrosis. El tratamiento con dexametasona redujo notablemente la fibrosis en ratones deficientes en SHIP, acercando las puntuaciones a controles positivos en SHIP. La tinción con azul de alcio y PAS confirmó hiperplasia de células caliciformes en ratones deficientes en SHIP, que se redujo visiblemente tras el tratamiento con dexametasona.

Las concentraciones de beta de IL-1 se elevaron significativamente en ratones deficientes en SHIP en comparación con los controles de SHIP. La dexametasona redujo significativamente las concentraciones de IL-1beta en ratones deficientes en SHIP. Las concentraciones de MPO fueron significativamente elevadas en ratones deficientes en SHIP en comparación con los controles de SHIP, y este aumento se redujo con la dexametasona sin alcanzar la significación estadística.

Las concentraciones de LCN-2 también se elevaron en ratones deficientes en SHIP, pero los valores altos no se redujeron de forma consistente con la dexametasona. Las concentraciones de IL-1 beta se correlacionaron positivamente con las puntuaciones de daño histológico y de fibrosis, indicando un vínculo entre inflamación y lesión tisular. Las puntuaciones de daño histológico se correlacionaron positivamente con las de fibrosis, lo que sugiere que el daño tisular y la remodelación fibrótica progresaron en paralelo.