Modelo de Ratón de Embolia Microvascular para Microscopía de Dos Fotones In Vivo usando Microsferas de Poliestireno Fluorescente
21 de noviembre de 2025
Este protocolo contiene una descripción detallada de un enfoque paso a paso para un modelo ratón de ventana craneal crónica y embolia microvascular, optimizado para la imagen in vivo de microscopía de dos fotones utilizando microesferas fluorescentes de poliestireno.
Utilizando este método de inyección de microesferas, pretendemos desentrañar las consecuencias a corto y largo plazo del tapado capilar para investigar los posibles mecanismos de eliminación del émbulo en la red capilar cerebral. Permite la obtención de imágenes in vivo en tiempo real y el seguimiento de partículas fluorescentes en la red capilar cortical. Las microsferas y las consecuencias locales pueden seguirse durante semanas tras la inyección.
Nuestros estudios ayudan a comprender el daño tisular local causado por las oclusiones microvasculares. Estos resultados podrían conducir a nuevas estrategias de tratamiento. Ahora podemos estudiar día a día y durante semanas cómo el tapón capilar, altera vasos, activa células, modifica el flujo sanguíneo y daña la barrera hematoencefálica.
Para empezar, pellizca el dedo de un ratón anestesiado para verificar la profundidad de la anestesia. Realizar una incisión mediana de aproximadamente 0,5 centímetros sobre la tráquea bajo la mandíbula utilizando tijeras quirúrgicas y pinzas de disecación. Disecciona el tejido conectivo superficial a la fascia cervical utilizando pinzas microsuturas para exponer los músculos hioides esternales subyacentes.
Ahora, separa los músculos hioides esternales izquierdo y derecho rasgando suavemente el tejido conectivo entre ellos. Retrae el músculo omohioideo derecho caudal lateralmente con un gancho de tejido. Asegúrese de que el triángulo carotídeo derecho, incluyendo la arteria carótida común, la arteria carótida interna y la arteria carótida externa, sea claramente visible.
A continuación, retira cualquier fascia y tejido adiposo que quede alrededor de la arteria carótida común. Separa cuidadosamente la arteria carótida común del nervio vago. Coloca dos hilos 4/0 de 1,5 alrededor de la arteria carótida común y átalos de forma floja, asegurándote de que los nudos no impidan el flujo sanguíneo.
Retirar la fascia y el tejido adiposo de la arteria carótida interna y la arteria parietal posterior. Luego, liga temporalmente la arteria parietal posterior y todas las ramas internas del lado carótido, incluida la arteria occipital, atando un nudo con un hilo 4/0 1.5. Retirar la fascia y el tejido adiposo de la arteria carótida externa y la temporal.
Coloca dos nudos sueltos alrededor de la arteria carótida externa y la temporal usando roscas tamaño 4/0 1.5. Coloca el hilo más distal lo más alejado posible de la bifurcación en Y y úsalo para ligar permanentemente la arteria carótida externa y la temporal. Deja el nudo proximal suelto.
Homogeneizar y sonicar las microesferas de 10 micrómetros para obtener una suspensión uniforme de partículas individuales. Añadir 20 microlitros de microesferas homogeneizadas a 140 microlitros de FITC-Dextran para obtener un volumen final de 160 microlitros de mezcla que contiene 1,44 por 10 a la potencia de cinco microesferas. Retrae brevemente la jeringuilla conectada al catéter para crear una esclusa de aire.
Luego sumerge la punta del catéter en la mezcla preparada de FITC-Dextran/Tween20/microesfera y retira lentamente la jeringuilla hasta que la mezcla esté en el catéter. Asegúrate de que no haya burbujas de aire en el catéter. Coloca la jeringuilla con el catéter cargado en la bomba de la jeringuilla.
Ajusta la bomba a 10 microlitros por minuto y haz funcionar hasta que aparezca una pequeña gota de mezcla de microsfera en la punta del catéter. Ahora, coloca un clip para el vaso en la arteria carótida interna y aprieta uno de los nudos proximales previamente preparados alrededor de la arteria carótida común. Con microtijeras, realiza una pequeña incisión diagonal en la arteria carótida externa aproximadamente 0,5 milímetros distal al hilo de ligadura, asegurando que el tamaño de la incisión sea ligeramente menor que el diámetro del catéter.
Absorbe cualquier sangre con un paño estéril. Enciende brevemente la bomba de jeringuilla para formar una gota de mezcla de microsfera en la punta del catéter, confirmando que no queda aire en la punta del catéter. Abre la incisión de la arteria carótida externa e inserta el catéter usando micropinzas finas.
Luego asegura el catéter en la arteria carótida externa apretando la sutura proximal alrededor de la arteria carótida externa. Bombea gradualmente a 10 microlitros por minuto hasta que la arteria se agrande visiblemente y el colorante verde FITC llene la arteria carótida externa, confirmando la inyección exitosa. A continuación, retira el clip del vaso de la arteria carótida interna.
Luego aumenta el caudal de la bomba de jeringuilla a 20 microlitros por minuto. Confirma la inyección exitosa de la microesfera verificando que la bifurcación de la arteria carótida interna, distal a la arteria parietal posterior, esté llena de tinte FITC. Una vez que la inyección tiene éxito, se retira el hilo que ligaba la arteria carótida común para permitir que la mezcla de microesferas fluya hacia la arteria carótida interna.
Durante la inyección, el contraste FITC aún puede observarse en la arteria carótida externa. Apaga la bomba de jeringuilla una vez que la mezcla en el catéter alcance los 80 microlitros para detener la inyección. Luego liga la arteria carótida común, corta la carótida interna y retira suavemente el catéter, manteniendo el hilo de fijación en su sitio.
Liga permanentemente la arteria carótida externa apretando el hilo que había sujetado el catéter. Retira el clip del vaso y los hilos alrededor de la arteria carótida común, la arteria carótida interna y la arteria parietal posterior para restablecer el flujo sanguíneo. El éxito de la cirugía de embolia microvascular se confirmó mediante una autopsia post situ de todo el cuerpo y del cerebro completo cuatro días después de la cirugía.
Una rebanada sagital del cerebro mostró el alojamiento de microesferas en el cerebro. Los cerebros de ratón extraídos un día después de la cirugía mostraron que las microesferas estaban predominantemente alojadas en el hemisferio ipsilateral dentro del territorio de flujo de las arterias cerebrales media y anterior. El recuento de microesferas en las rebanadas cerebrales aumentó significativamente cuando se añadió Tween20 a la mezcla de microsferas.
Los ratones perdieron menos peso y se recuperaron más rápido tras la cirugía cuando se les inyectó una mezcla de microesferas que contenía Tween20. Las imágenes de microscopía de fluorescencia de la corteza cerebral tomadas 0,5 horas después de la cirugía mostraron puntos blancos individuales, que representan microesferas que ocultan capilares. Las imágenes de proyección Z-stack de dos fotones mostraron microesferas causando embolias microvasculares cerebrales con perfusión alterada.
Las embolias también provocan alteraciones de la barrera hematoencefálica con fugas visibles de colorante desde los vasos.
Descripción general
Este protocolo describe un enfoque detallado paso a paso para crear una ventana craneal crónica y un modelo de embolismo microvascular en ratón, optimizado para imágenes por microscopía de dos fotones in vivo. El método utiliza microesferas de poliestireno fluorescentes para investigar los efectos del taponamiento capilar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación microvascular
- Técnicas de imagen in vivo
Antecedentes
- Comprender las consecuencias de las oclusiones microvasculares es fundamental para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento.
- La imagenología en tiempo real permite el seguimiento de partículas fluorescentes en la red capilar cerebral.
- Estudios previos han demostrado que el taponamiento capilar puede provocar daño tisular local.
- Esta investigación tiene como objetivo esclarecer los mecanismos de eliminación de émbolos en el cerebro.
Objetivo del estudio
- Investigar los efectos a corto y largo plazo del tapón capilar.
- Comprender cómo las oclusiones microvasculares afectan el flujo sanguíneo y la barrera hematoencefálica.
- Explorar estrategias terapéuticas potenciales para condiciones relacionadas con daño microvascular.
Métodos Utilizados
- Creación de una ventana craneal crónica en ratones para la obtención de imágenes.
- Inyección de microesferas fluorescentes para inducir embolismo microvascular.
- Uso de microscopía de dos fotones para la obtención de imágenes en tiempo real.
- Obtención de imágenes tras la cirugía para confirmar la retención de microesferas en el cerebro.
Resultados principales
- Las microesferas se alojaron predominantemente en el hemisferio ipsilateral.
- Se observó un aumento en el recuento de microesferas con la adición de Tween20.
- Los ratones inyectados con Tween20 mostraron una recuperación más rápida tras la cirugía.
- La microscopía de fluorescencia reveló la oclusión de los capilares por las microesferas.
Conclusiones
- Este método permite un estudio detallado de las oclusiones microvasculares in vivo.
- Los hallazgos podrían conducir a nuevas perspectivas sobre estrategias de tratamiento para afecciones microvasculares cerebrales.
- El estudio mejora la comprensión de la dinámica del flujo sanguíneo y del daño tisular en el cerebro.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos de embolismo microvascular mediante microesferas fluorescentes y microscopía de dos fotones in vivo proporcionan una plataforma sólida para desentrañar los mecanismos y consecuencias de las microoclusiones cerebrales. Este enfoque permite un seguimiento longitudinal con alta resolución de los eventos vasculares y las respuestas del tejido, lo que respalda la confianza predictiva en la validación temprana de dianas neurovasculares. La reproductibilidad del modelo y sus resultados cuantitativos de imagen lo posicionan como un recurso valioso para la triage de carteras y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos neurovasculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar hipótesis sobre lesiones neurovasculares mediante la inducción controlada de microoclusiones.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al visualizar las respuestas vasculares, celulares y de la barrera hematoencefálica a lo largo del tiempo.
- Facilita la validación funcional de objetivos al vincular eventos de embolismo con daños tisulares posteriores y la dinámica de eliminación.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un sistema in vivo validado para la evaluación cuantitativa de la oclusión microvascular y la reapertura.
- Genera imágenes reproducibles y de alto contenido adecuadas para la estandarización de ensayos y comparaciones entre estudios.
- Permite el cribado de intervenciones candidatas dirigidas a la eliminación de émbolos o a la protección neurovascular.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad de lesión microvascular cerebral, para la exploración traslacional de biomarcadores.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, al posibilitar el seguimiento longitudinal de resultados.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de las respuestas del tejido y vasculares a microoclusiones.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este modelo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, conectando estudios mecanicistas e investigación traslacional en biología neurovascular.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre lesiones microvasculares y mecanismos de eliminación mediante imágenes en tiempo real.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para evaluar terapéuticas candidatas in vivo.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la carga de embolismos, el daño tisular y la recuperación entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con puntos finales relevantes para la enfermedad y el desarrollo de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y reutilizable para la investigación neurovascular y la evaluación de intervenciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos neurovasculares y en la reducción de riesgos mecanicistas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante protocolos estandarizados de imagen y administración.
- Valor estratégico: Perfecciona las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos cuantitativos y longitudinales sobre los resultados vasculares y tisulares.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de programas neurovasculares basándose en evidencia robusta in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, imagenología in vivo y análisis cuantitativo de eventos vasculares.
- Exige acceso a microscopía de dos fotones e infraestructura de imagenología tridimensional post mortem.
- Necesita estandarización entre equipos de las mezclas de inyección y los protocolos de imagenología para lograr reproductibilidad.
- Adaptable a diversos modelos de ratón, aunque puede requerir optimización para diferentes territorios vasculares.
- Las limitaciones potenciales incluyen la complejidad técnica y la necesidad de monitoreo longitudinal de los animales.
