Pruebas de biodegradación aeróbica de materiales utilizando un inóculo natural de agua de mar marina y un respirómetro de circuito cerrado

Nuestra investigación cuantifica la tasa de biodegradación aeróbia y el grado de materiales naturales en el entorno marino utilizando el inoculo natural de agua de mar para la comparación de datos. Nuestros desafíos experimentales actuales incluyen una capacidad limitada de pruebas y la falta de infraestructura para satisfacer la creciente demanda de pruebas de biodegradación, asegurando al mismo tiempo métodos uniformes y transparentes en los laboratorios. Para empezar, recoge entre 10 y 20 litros de agua de mar en un garrafón de 20 litros lixiviado con ácido usando una botella grande de Niskin.

Transporta el damajuana lleno de vuelta al laboratorio. Transfiere un litro de agua de mar entera desde el damajuana a una botella de HDPE ámbar de un litro lixiviada con ácido para el análisis de partículas de carbono y nitrógeno. Filtra a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,2 micrómetros, baja en nitrógeno.

Ahora, llena un frasco volumétrico de uno, dos o cuatro litros hasta la mitad con agua de mar. Si el agua de mar tiene materia orgánica de alta cantidad de partículas, colárala a través de una malla de 20 micrómetros para eliminar partículas grandes y heterogéneas. Luego se recogen 60 mililitros de filtrado en una botella de polietileno lixiviado con ácido para análisis disueltos de nitrógeno inorgánico y orgánico y fósforo.

Cubre de forma suelta la abertura del damajuana para permitir condiciones aeróbicas. Guárdalos a oscuridad a 30 grados Celsius durante hasta siete días. A continuación, coloca entre 10 y 15 gramos del sustrato experimental en un tarro de acero inoxidable de 50 mililitros.

Con una bola de acero de 20 milímetros. Sumerge el tarro de molienda en nitrógeno líquido durante 15 minutos para debilitarlo. Asegura el tarro de fresado en el accesorio del molino de bolas.

Luego pon el instrumento a 30 hercios y dos minutos y 30 segundos, y pulsa start. Realiza la molienda cuatro veces con 30 segundos de enfriamiento en nitrógeno líquido entre cada ciclo. Fresa el sustrato hasta un tamaño de partícula uniforme entre 0,10 y 0,25 milímetros antes del inicio de la prueba.

Utilizando una balanza de precisión con sensibilidad de 0,001 gramos, pesa 0,5 gramos por litro de cloruro de amonio y 0,1 gramos por litro de fosfato potásico monobásico. Añade los nutrientes inorgánicos al frasco. Lleva el volumen para marcar con agua de mar.

Luego se mete en una barra agitadora y se remueve en un plato hasta que todas las sales se disuelvan. En una balanza analítica, pesa 20 miligramos del sustrato experimental o de control. Anota el peso completo de la lectura y deja el vial a un lado.

Para montar los recipientes del reactor, se utiliza una pipeta volumétrica de 75 mililitros lixiviada con ácido y un controlador motorizado y se aspira el agua de mar para dispensar 75 mililitros de agua de mar suplementada con nutrientes en cada recipiente del reactor. Retirar aproximadamente tres mililitros de agua de mar de cada embarcación. Luego colócalo sobre una superficie limpia junto al recipiente para enjuagar el sustrato molido del frasco rasgado.

Ahora transfiere el sustrato molido al recipiente correspondiente del reactor desde el vial rasgado. Coloca una junta tórica en el borde del recipiente del reactor. Luego coloca una tapa de dos puertos sobre la junta tórica y fijala con un tapón de rosca.

Conecta cada vaso del reactor a sus líneas de gas o condensación correspondientes. Inserta firmemente las líneas de gas en los puertos de entrada y salida adecuados de la tapa. Enciende la plataforma shaker a 0,05G en modo continuo.

Comprueba visualmente que todos los recipientes estén bien seguros y luego cierra la puerta de la incubadora. En el software del instrumento, navega a Experimento y haz clic en Configurar. Introduce los números de los canales de inicio y final desde los menús desplegables correspondientes a los canales ocupados.

Pon el umbral de actualización en 0,50. Intervalo de refresco a NA y ventana de refresco a Auto. Luego marca la casilla de sensores de purga en Configuración Diversa.

Asegúrese de que no estén seleccionadas las opciones de Medición de Volumen Automático, Consumo de Oxígeno Positivo y Activar Modo de Flujo Abierto. Establece el intervalo de muestra a 8,00. Luego ajusta las unidades de gas y tiempo según sea necesario.

Si se utiliza una sonda de temperatura primaria para la corrección de la temperatura de incubación, asegúrese de no seleccionar manualmente Introducir las temperaturas de la cámara. Marca la casilla de Modo Ventilación y asegúrate de que no esté seleccionado Modo Drenaje. Ahora, selecciona Configuración de la Cámara e introduce las etiquetas descriptivas del canal.

Si se indica una fuga, asegúrese de que la junta tórica esté limpia, asentada y libre de partículas o fibras. Aprieta el tapón de rosca. Inspecciona las conexiones de las tuberías en la entrada y salida.

Recorta los tubos desgastados o deformados con una hoja afilada para producir cortes limpios. Desde el menú, selecciona Herramientas, luego haz clic en Menú de Servicio y confirma que la sonda primaria de temperatura mide 30 grados Celsius con variaciones de dos grados y es estable. Haz clic en ejecutar para comenzar el experimento.

Guarda el archivo del experimento bajo un nombre descriptivo, incluyendo la fecha, y registra el nombre del archivo en la hoja de datos. La producción acumulada de dióxido de carbono durante 84 días confirmó el rendimiento esperado. Durante 84 días, la celulosa mostró una rápida producción de dióxido de carbono tras un breve retraso, y alcanzó unos 700 micromoles.

PHA mostró una tasa inicial más lenta durante tres días. Y el control de agua de mar se mantuvo bajo, en 150 micromoles. Las réplicas individuales negativas de control mostraron baja variabilidad, manteniendo todas las curvas muy juntas.

Las réplicas de control positivo en celulosa mostraron una variabilidad consistentemente baja, confirmando un rendimiento estable en las cuatro réplicas. En el conjunto de datos negativo, el réplicado cinco mostró un pico anómalo en la tasa de producción de dióxido de carbono, probablemente debido a materia orgánica lábil, pero su producción acumulada comenzó a estabilizarse en 100 micromoles. Réplicas de uno de cada seis tenían una producción acumulada de dióxido de carbono menor en comparación con otros, lo que sugiere posibles problemas técnicos.

El error estándar de la producción media acumulada de dióxido de carbono en el control negativo fue del 2,5%, lo que indica baja variabilidad entre replicados. El error estándar para el control positivo de celulosa fue del 0,83%, lo que confirma además una alta reproducibilidad del ensayo de biodegradación. PHA tiene una alta mineralización cercana al control positivo con un error estándar comparable al control.

Este protocolo aborda la brecha en los métodos estandarizados accesibles para el cribado de la biodegradabilidad de materiales en el entorno marino para la industria, el ámbito académico y los organismos reguladores. El protocolo proporciona una forma estandarizada más rápida de medir directamente esta biodegradación, con una duración de prueba más corta en la evaluación simultánea de la muestra. El protocolo permite pruebas estandarizadas de alto rendimiento para la comparabilidad de materiales y laboratorios para aprendizaje automático y modelado predictivo del rendimiento de materiales.