Flujo de trabajo estandarizado SDS-PAGE para el perfilado personalizado de corona de proteínas en la detección temprana del cáncer

Estudiamos cómo las nanopartículas interactúan con la sangre para revelar signos tempranos de cáncer, con el objetivo de realizar una prueba diagnóstica sencilla, reproducible y principalmente no invasiva. Para empezar, diluye la solución de cuatro miligramos por mililitro de nanoláminas de óxido de grafeno en agua ultrapura hasta la concentración deseada. Sonicar la solución diluida durante dos minutos a un 28% de amplitud con un ajuste de pulso de ocho segundos encendido y seis segundos apagado para asegurar una dispersión uniforme.

Cuantifique la concentración de la solución dispersa utilizando espectroscopía ultravioleta visible. Luego mide el tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de la solución usando dispersión dinámica de luz con un láser de helio neón de 633 nanómetros. Diluye la muestra en agua ultrapura según los límites de detección QVet.

A continuación, diluir el plasma humano liofilizado comercial con agua ultrapura según sea necesario. Centrifugar el plasma reconstituido a 18.620 G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Recoge el sobrenadante y guárdalo a menos 80 grados Celsius hasta que se use más.

Ahora, cuantifiquen la concentración de proteínas usando el ensayo de ácido bicincónico para ajustar la dilución plasmática y determinar la proporción óptima de nanopartículas respecto al plasma. Mezcla el volumen seleccionado de nanopartículas con plasma para lograr la proporción objetivo entre ambos. Incuba la mezcla a 37 grados Celsius durante una hora.

Para aislar la corona proteica, centrifugar las muestras de plasma de nanopartículas a 18.620 G a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Lava el pellet resultante con 200 microlitros de agua ultrapura. Luego vuelve a suspenderlo y centrifugarlo de nuevo.

Tras el lavado final, confirmar la presencia de un pellet compacto como evidencia del aislamiento de complejos proteicos de nanopartículas. A continuación, mezcla el agente reductor, el tampón de carga y el agua para alcanzar el volumen calculado del tampón de carga. Resuspende el perdigón en el buffer de carga preparado.

Luego hierve la suspensión a 100 grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugar la muestra hervida a 18.620 g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Recoge el sobrenadante en un tubo nuevo.

Ahora, prepara la escalera de proteínas diluyendo el estándar de peso molecular en un tampón sin teñir con el tampón teñido. Diluye 10 x Tris-Glicina-SDS con buffer de funcionamiento a una concentración x. Monta la cámara de electroforesis usando un gel gradiente libre de tinción del cuatro al 20%.

Luego vierte el buffer de funcionamiento hasta que alcance el nivel recomendado indicado por el fabricante. Carga 10 microlitros de muestra en cada pozo. Luego pipetear siete microlitros de escalera en cada pozo.

Haz funcionar el gel a 150 voltios durante aproximadamente 90 minutos a temperatura ambiente. Guarda la imagen gel como un archivo tiff en la misma carpeta que los scripts. Luego abre el procesamiento en gel.

M en MATLAB. Introduce el nombre de la imagen en gel como nombre de la imagen. Luego introduce el índice de un carril de escalera como marcador de índice.

Ejecuta el guion. La finalización de los pasos se indicará en la ventana de comandos y aparecerán cuatro ventanas en la pantalla. Ahora, abre la figura uno con la imagen original del gel arriba y su corrección para el efecto de carril oblicuo en la parte inferior.

Modifica los valores de corrección a la izquierda y derecha para ajustar los parámetros de corrección. Figura Dos abierta. Contiene la imagen corregida por el efecto de carril oblicuo en la parte superior y la imagen eliminada del fondo en la parte inferior.

Ajusta el valor de BKG par X en el script para ajustar la eliminación de fondo. Observa que todos los carriles identificados están indicados como líneas blancas verticales en la Figura dos. Ahora, abre la Figura Tres que contiene el perfil de intensidad del carril marcador con los picos detectados a la izquierda y un ajuste no lineal con el valor de R al cuadrado a la derecha.

Comprueba dos veces que el número de bandas esperadas en el carril de escalera coincide con el número de picos detectados usados para el procedimiento de ajuste. Luego abre la Figura Cuatro que contiene los perfiles de intensidad normalizados para todas las líneas detectadas en el gel. Establece el parámetro de exportación en uno para exportar los perfiles de intensidad como funciones de los pesos moleculares en un archivo de Excel.

Ejecuta el guion. Tras completarla, se generará una hoja de Excel en la carpeta de trabajo que contiene los perfiles absoluto y normalizado en función del peso molecular en la primera columna. Luego abre el gel profiles pro m y ejecuta el script.

Aparecen cuatro ventanas en la pantalla. Abre la Figura Cinco que contiene los perfiles de intensidad absoluta en la parte superior y las correspondientes intensidades totales en la parte inferior para cada carril. Y la Figura Seis contiene los perfiles de intensidad normalizados para cada carril.

Con el eje del peso molecular subdividido según los rangos especificados como reg en el guion. Configura los datos de exportación a uno para exportar las áreas absolutas y integrales normalizadas. Ejecuta el guion.

Tras finalizar, se generará una hoja de cálculo en la carpeta de trabajo que contiene las áreas absolutas y normalizadas exportadas dentro de los rangos de peso molecular especificados. Por último, abre la Figura Siete y Ocho. Contienen el histograma de áreas absolutas y normalizadas para cada carril, agrupadas por carril y por área respectivamente.

El protocolo presentado aquí establece un flujo de trabajo estandarizado y reproducible para aislar y caracterizar la corona proteica formada en nanopartículas tras la incubación con plasma. Este método produce perfiles de página SDS altamente consistentes capaces de capturar características biológicamente significativas y diagnósticamente relevantes de cada corona personalizada. Los perfiles de página SDS obtenidos en todas las condiciones eran altamente reproducibles.

El aumento de las concentraciones plasmáticas del 5% al 50% resultó en intensidades de señal más fuertes en la región de 30 a 80 kilodaltones de los perfiles de página SDS. El flujo de trabajo automatizado de pipeteo produjo perfiles electroforéticos casi idénticos. El óxido de grafeno producía consistentemente perfiles de corona estables bien resueltos, atribuidos a su alta superficie y propiedades cargadas.

Las distribuciones de tamaño de las muestras pequeñas, medianas y grandes de óxido de grafeno eran estrechas, no solapadas y centradas en torno a 100, 300 y 750 nanómetros respectivamente. Los perfiles de las páginas SDS de las coronas de proteínas formadas en óxido de grafeno eran similares en tamaños. Aunque se observaron diferencias claras entre diferentes diluciones, concentraciones plasmáticas más bajas produjeron bandas más intensas en rangos específicos de peso molecular, indicando un enriquecimiento selectivo de proteínas.

En las diluciones plasmáticas intermedias, los perfiles de la métrica de densidad revelaron diferencias específicas de la enfermedad, especialmente en la región de 20 a 30 kilodaltones, donde las muestras de PDAC mostraron una intensidad de señal reducida. El modelo de perfilado basado en páginas SDS por sí solo identificó correctamente tanto muestras PDAC como de control con un 83% de precisión y sensibilidad y especificidad equilibradas. El modelo diagnóstico combinado que incorpora perfiles de corona de páginas SDS y niveles CA 19 a 9 logra la mayor precisión, sensibilidad y especificidad en la clasificación de pacientes con PDAC.

Utilizamos flujos de trabajo automatizados, técnicas no basadas en tecnología y herramientas impulsadas por IA para avanzar en la investigación diagnóstica del cáncer. Nuestro protocolo es rápido, fácil de usar y cumple con la OMS, asegurando las huellas estandarizadas reproducibles de la corona con una fuerte relevancia diagnóstica.