Preparación y procesamiento de arterias calcificadas con morfología y ARN preservados para perfilado espacial digital

La transcriptómica espacial ofrece una ventaja sobre el seq de ARN unicelular y el seq de ARN a granel al preservar la información espacial dentro del tejido. Mediante el uso de herramientas como RNAscope, deconvolución computacional y conjuntos de datos de células únicas disponibles públicamente, es posible mapear el comportamiento celular a su nicho y perfiles génicos y construir una visión integrada de la biología tisular. Esta tecnología está explotando.

Dos artículos de mayo de 2025 en Nature se centran en estudios de transcriptómica espacial. Si representamos PubMed, la curva es aún más pronunciada: aproximadamente 150 artículos espaciales en 2023, casi 300 en 2024, y en camino de superar las 500 publicaciones en 2025. La transcriptómica espacial ya ha transformado varias áreas de investigación importantes, como la biología del cáncer, la neurociencia, la inmunología y la biología del desarrollo.

Sin embargo, la biología vascular va rezagada. La heterogeneidad y la geometría única de las arterias y venas dificultan la inserción tisular y la preservación del ARN. Además, las lesiones vasculares avanzadas presentan calcificación y trombosis, que reducen aún más la integridad tisular.

Este protocolo está diseñado específicamente para estructuras similares a embarcaciones. También incluimos metodologías para reducir el coste y los procesos de tinción necesarios para evaluar ARN, depósitos de calcio y células de interés. Dada la actual escasez de estudios de transcriptómica espacial enfocados en vasculares en comparación con otros campos, este protocolo está diseñado para ser rentable y accesible para principiantes, proporcionando a los investigadores vasculares herramientas accesibles para adoptar la transcriptómica espacial en sus estudios.

Este protocolo también puede ser útil para muestras de cohorte grandes en experimentos clínicos. En este protocolo, describimos procedimientos detallados que cubren el manejo cuidadoso de tejidos arteriales calcificados, métodos de calcificación de propiedades destinados a preservar la calidad del ARN y la morfología tisular, técnicas de tinción para verificación y orientación durante la selección del ROI, y la tinción final de marcadores morfológicos en portaobjetos preparados, asegurando que estén listos para su procesamiento en el instrumento digital de perfilador espacial. Las arterias tibiales humanas, incluyendo las arterias tibial anterior, tibial posterior y perineal, se extrajeron de muestras de amputación de pacientes y se almacenaron en DMEM que contenía 1% HEPES y 1% Pen-Streptococo.

Cada arteria se transfiere a una placa de Petri de 100 milímetros junto con el medio. El exceso de tejido conectivo perivascular se elimina utilizando tijeras y pinzas estériles, dejando solo la pared arterial. La arteria recortada se transfiere a una nueva placa de Petri.

Se prepara una tabla de cortar estéril dentro del plato. Las arterias se cortan en segmentos de un centímetro usando una hoja quirúrgica. Dos segmentos de cada arteria se congelan rápidamente en criotubos en nitrógeno líquido para la criopreservación y almacenamiento para futuros trabajos de proteínas o ARN.

Los segmentos restantes se colocan en tubos de 15 mililitros que contienen formalina amortiguada con un 10% de neutro y se fijan a cuatro grados Celsius durante 24 a 48 horas. Se prepara la solución de descalcificación con 10% de EDTA en una solución estabilizadora de ARN, ajustando el pH a 5,2 para la solución de trabajo. Los pajidos fijos se transfieren a un plato nuevo que contiene PBS, y los pajidos se lavan brevemente.

Cada muestra se transfiere a un tubo de 15 mililitros que contiene solución de descalcificación y se agita a cuatro grados Celsius durante 72 horas. Tras completar la descalcificación, las muestras se lavan dos veces con PBS con una agitación suave durante cinco minutos. Los tejidos se transfieren a casetes.

Los casetes se colocan en un procesador de tejido. El procesamiento de formolina se realiza durante al menos cuatro horas. El tiempo puede variar según la matriz muestral.

Se colocan varios segmentos de arteria por bloque. El bloque se rellena con parafina y se deja enfriar completamente. Las láminas se preparan marcando la zona de tejido restringida en la parte trasera de las llapas.

Confirme que todos los segmentos se encuentran dentro del área restringida requerida por el instrumento GeoMx DSP. El exceso de parafina se recorta de los bloques. Los bloques se seccionan a cinco micras con láminas de perfil bajo.

Las cintas de tejido se montan dentro de la zona marcada. En el experimento DSP se montan al menos cuatro secciones en serie por bloque para diferentes tintes. Guarda los portaobjetos a cuatro grados Celsius hasta su uso.

A continuación, se realiza la hibridación in situ con ARNscopo, así como la tinción histológica, en portaobjetos preparados en serie. Además, otro conjunto de láminas está teñido con marcadores morfológicos, como CD45 para las células inmunitarias y alfa-SMA para las células del músculo liso. El procedimiento de hibridación in situ de ARNAscope consta brevemente de cuatro pasos principales: cocción de láminas como pretratamiento, deparafinización y rehidratación estándar, recuperación de objetivos, hibridación con sonda con amplificación de señal y tinción con colorante para visualización de ARN.

Para la validación histológica, se realizan tanto la tinción H&E como la tinción con Alizarina Red S para permitir la localización precisa de depósitos de calcio. Finalmente, la tinción morfológica de marcadores se realiza mediante un protocolo inmunohistoquímico estándar para identificar las células de interés, guiando la selección del ROI. En este estudio se compararon dos protocolos basados en EDTA: uno, 10% de EDTA solo durante 72 horas, y dos, solución estabilizadora de 10% de EDTA y ARN durante la misma duración.

La morfología y la calidad del ARN se evaluaron mediante hibridación in situ mediante RNAscope. Ambos métodos preservaron la arquitectura de vasos, pero las láminas tratadas con el cóctel de solución estabilizadora de ARN y EDTA mostraron señales de ARN notablemente más fuertes, como se demuestra en el panel derecho, lo que indica que la solución estabilizadora de ARN protege los transcritos mientras que la EDTA quela el fosfato de calcio cristalino y suaviza gradualmente la muestra sin activar las RNasas. Con la estrategia de preservación del ARN optimizada y la calidad confirmada, demostramos los pasos para la tinción histológica para la deposición de calcio utilizando hematoxilina y eosina y Alizarina Roja S. La alizarina une selectivamente sales iónicas de calcio y cambia de tono de naranja a rojo ladrillo, destacando sensiblemente micro y macro calcificaciones, aunque proporciona menos detalle celular y extracelular de la matriz que H&E.

Usar ambas tinciones maximiza la información estructural y composicional. Tras la tinción con marcadores morfológicos, las diapositivas se escanean en la plataforma GeoMX. El anticuerpo CD45 marca las células inmunitarias, mientras que el músculo alfa-liso actina marca las células musculares lisas vasculares abundantes en el medio.

Los ROI seleccionados abarcan aproximadamente entre 100 y 150 núcleos con un rendimiento adecuado de ARN. Los ROI se colocaron adyacentes y alejados de áreas calcificadas para comparar patrones de expresión génica espacial relevantes para la calcificación medial de la arteria tibial. A pesar de cierta pérdida de tejido durante los pasos de procesamiento de varias horas, se identificaron múltiples retornos de inversión adecuados en cada sección de la arteria.

Para concluir, este flujo de trabajo abarca la manipulación del tejido arterial calcificado y la descalcificación mediante la tinción de validación y la selección de ROI para un estudio de transcriptómica espacial. En particular, combinar H&E con tinción específica de calcio con alizarina garantiza una localización precisa de la calcificación vascular y maximiza tanto la información estructural como compositiva para la colocación del ROI. El análisis de ARNscopio muestra que las secciones arteriales descalcificadas permanecen en gran medida intactas con suficiente ARN.