El ARN largo no codificante PVT1 mejora la glucólisis en el carcinoma de tiroides al estabilizar HIF-1α y activar la transcripción del gen glucolítico

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para examinar cómo lncPVT1 regula la estabilidad de HIF-1α y la expresión génica glucolítica en células de cáncer de tiroides, lo que permite el estudio de la regulación metabólica y posibles objetivos terapéuticos.

Resumen

Como el principal cáncer del sistema endocrino, el carcinoma de tiroides exhibe una tendencia epidemiológica acelerada en todas las poblaciones. A pesar de los avances en las modalidades de tratamiento, la recurrencia y la metástasis siguen siendo un desafío. El ARN largo no codificante PVT1 (lncPVT1) ha surgido como un regulador oncogénico conservado en múltiples tipos de cáncer, pero su función específica en CT requiere una mayor exploración. Nuestra investigación se centró en examinar cómo lncPVT1 afecta la glucólisis en condiciones normóxicas e hipóxicas utilizando las líneas celulares TC TPC-1 y K1. La sobreexpresión de lncPVT1 mejoró significativamente el consumo de glucosa y la producción de lactato bajo hipoxia, corroborando su capacidad para aumentar la glucólisis. Además, lncPVT1 reguló al alza genes glucolíticos clave como GLUT1, HK1, HK2 y PGK1, y facilitó la proliferación de células TC. Mecánicamente, lncPVT1 estabilizó el factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) impidiendo su degradación y provocando su acumulación. Este HIF-1α acumulado luego se unió a secuencias reguladoras específicas que controlan la expresión de genes involucrados en la glucólisis, activando finalmente estos genes y aumentando la actividad glucolítica. Nuestros hallazgos demuestran que lncPVT1 regula la estabilidad de HIF-1α y la expresión génica glucolítica, lo que mejora nuestra comprensión del metabolismo de CT y potencialmente revela nuevos objetivos terapéuticos.

Introducción

El cáncer de tiroides (CT), una neoplasia maligna endocrina altamente prevalente, ha experimentado un rápido aumento en las tasas de incidencia¹. A pesar de los avances en las estrategias terapéuticas, incluidos los procedimientos quirúrgicos, la radioterapia y la terapia de supresión hormonal tiroidea, una proporción sustancial de pacientes con CT aún enfrentan el riesgo de recurrencia tumoral y metástasis, lo que enfatiza la necesidad de una comprensión más profunda de su patogénesis molecular ^2,3. El desarrollo de CT se asocia con varios factores de ....

Protocolo

Cultivo celular y transfección

Las líneas celulares de carcinoma de tiroides humano (CT) TPC-1 y K1 se cultivaron en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contenía 4,5 g/L de glucosa, suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Para el tratamiento de la hipoxia, se transfirieron 1 x 10⁵ células a una cámara hipóxica sellada equilibrada con 1% de O₂, 5% de CO₂ y 94% de N₂ a 37 ° C durante 24 h, a menos que ....

Resultados

Glucólisis mejorada en líneas celulares TC mediada por lncPVT1

Inicialmente establecimos lncPVT1 OE y NC en células TPC-1 y K1 utilizando un sistema de expresión lentiviral. La sobreexpresión exitosa de lncPVT1 se confirmó mediante qRT-PCR (Figura 1A-B). Para evaluar el impacto en la glucólisis, las células se cultivaron bajo normoxia e hipoxia durante 24 h. Nuestro.......

Discusión

Como la neoplasia maligna endocrina más común, la CT plantea desafíos significativos en términos de su recurrencia y metástasis²². El panorama mecanicista de la carcinogénesis tiroidea permanece incompletamente definido, especialmente en lo que respecta a la regulación mediada por lncRNA de la reprogramación metabólica oncogénica y los comportamientos celulares fundamentales²³ . En este estudio, nos centramos en el lncPVT1 oncogénico y su i.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo de proteínas BCA	Meilunbio	MA0082-2	Ensayo de cuantificación de proteínas WB
Cabina de bioseguridad	Lishen	HFsafe-1200LC	Paso y expansión celular
Centrífuga	Baiyang	B320A	Celdas de centrífuga
Sistema de imágenes de quimioluminiscencia	BIO-RAD (EE. UU.)	ChemiDoc Touch	Desarrollo del Banco Mundial
Incubadora CO2	Thermo (EE. UU.)	311	Cultivo celular
Kit de detección de quimioluminiscencia ECL	Meilunbio	MA0186-1	Desarrollo del Banco Mundial
Citómetro de flujo	BD	FACSCalbur	Ensayo de apoptosis por citometría de flujo
Microscopio invertido de fluorescencia	NIKON(Japón)	TS2-FL	Observación celular
Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia	ABI (EE. UU.)	7300	Experimento de PCR
GAPDH	Tecnología de proteínas	60004-1-IG	Anticuerpo de referencia interno WB
Kit de ensayo de glucosa	Jiancheng	A154-1-1	Ensayo bioquímico
HIF1A	BOSTER	A00013	Anticuerpo WB
IgG de cabra anti-ratón Affinipure conjugado con HRP (H + L)	Tecnología de proteínas	SA00001-1	Experimento de inmunohistoquímica (IHC)
Affinipure cabra anti-conejo IgG (H + L) conjugada con HRP	Tecnología de proteínas	SA00001-2	Experimento de inmunohistoquímica (IHC)
Línea celular K1	Banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China)	NA	Línea celular de carcinoma papilar de tiroides humano
Kit de ensayo de ácido láctico	Jiancheng	A019-2-1	Ensayo bioquímico
Lector de microplacas	Thermo (EE. UU.)	K3	Detección ELISA
Kit de preparación ultrarrápida PAGE Gel (15%)	Meilunbio	MA0384	Electroforesis WB
Instrumento de PCR	BIO-RAD (EE. UU.)	PTC100	Experimento de PCR
Marcador de proteína arcoíris preteñido	Meilunbio	MA0342	Electroforesis WB
Sistema de electroforesis vertical de proteínas	BIO-RAD (EE. UU.)	POWER PAC 200	Electroforesis WB
Tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (5X)	Tiempo de beyo.	P0015L	Electroforesis WB
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	sigma	151-21-3	Electroforesis WB
Línea celular TPC-1	Banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China)	NA	Línea celular de carcinoma de tiroides humano