Amyloide y la arquitectura Cross-Beta

Nuestra investigación utiliza la difracción de fibras de rayos X para investigar la estructura de la fibrilla amiloide cruzada beta y su organización molecular. Este protocolo utiliza difracción de fibras de rayos X para confirmar patrones cross-beta y elucidar arquitecturas de fibrillas. Este protocolo permite el análisis estructural de fibrillas amiloides, desde la confirmación de la organización cruzada beta hasta la elucidación de detalles moleculares adicionales.

Para empezar, alinea las fibrillas proteicas o peptídicas para producir un haz cuyos ejes de fibras son idealmente todos paralelos. Funde la cera de vela con una placa caliente hasta que se licue. Con un cortador de vidrio, corta capilares de vidrio borosilicato de 1 milímetro a una longitud de unos 2-3 centímetros.

Sumerge brevemente los capilares cortados en la cera líquida. Después, aspira la cera de la vela por acción capilar hasta aproximadamente 1-2 milímetros dentro del capilar. Ahora usa plastilina para fijar los capilares sellados horizontalmente dentro de una placa de Petri.

Mantenga un espacio de 0,5-2 milímetros entre los extremos rellenos de cera de los capilares. Con una pipeta, suspende cuidadosamente una gota de 10 microlitros de solución de fibrilla entre los extremos rellenos de cera de los dos capilares. Cubre la placa de Petri para proteger la muestra del polvo y déjala evaporar durante la noche.

Luego sella la placa para ayudar a mantener un ambiente de secado controlado. Para alinear las fibrillas amiloides en un capilar de vidrio, fija una jeringuilla de 1 mililitro con tubo de goma al extremo ancho de un capilar de vidrio siliconado de 0,7 milímetros de diámetro. Aspira 2-3 centímetros de suspensión de fibrillas en el capilar.

Sella un extremo del capilar con cera derretida y deja el otro extremo abierto para permitir la evaporación. Coloca el capilar en vertical y deja que se seque hasta que se forme un disco seco. Para alinear las fibrillas como una alfombra o película fina, coloca una muestra de fibrilla de alta concentración sobre una lámina de vidrio y tapa antes de secar al aire durante 24 horas.

Monta cuidadosamente el haz de fibrillas sobre una cabeza goniómétrica y orienta para que el haz de rayos X atraviese el hace. Si se utiliza una muestra de alfombra de fibrillas, orientarla de modo que el haz de rayos X pase por el borde de la alfombra. Examina la muestra bajo un microscopio óptico equipado con un polarizador cruzado para observar birrefringencia.

Posiciona la muestra en el haz de rayos X según si es un haz de fibras, una alfombra o un disco. Recoge un patrón de difracción utilizando equipos de rayos X internos o radiación sincrotrón. Para realizar el análisis de datos, sube el archivo al software de análisis de patrones de difracción CLEARER.

Navega hasta Patrón de Difracción y Configuración de Difracción para introducir los ajustes de difracción, incluyendo tamaño de píxel, fuente de rayos X y distancia de muestra al detector. Haz clic en Procesamiento de imagen y Rota para rotar la imagen de difracción de modo que el meridiano quede vertical. Utiliza el módulo de centrado navegando hasta Patrón de difracción y haciendo clic en Imagen central para centrar la imagen.

Define los ejes meridiano y ecuador. Guarda la imagen centrada para un análisis posterior. A continuación, especifique un ángulo adecuado a lo largo del meridiano y el ecuador.

Haz clic en Patrón de Difracción y luego en módulo de Media Radial para generar un gráfico de la posición de la señal de difracción. frente a la intensidad. Navega al módulo de Búsqueda de Picos desde el menú de Patrón de Difracción para medir y emitir automáticamente la señal de difracción.

Ajusta el ancho de búsqueda pico para detectar señales reales sin ruido. Utiliza la opción de zoom y medición para verificar la posición de salida de la señal de difracción usando el pico de hallazgo. Explora las dimensiones potenciales de la celda unitaria utilizando el módulo de Optimización de la Celda Unitaria.

Introduce estimaciones iniciales basadas en señales ecuatoriales fuertes y define los índices mínimo y máximo para la búsqueda celular. Calcular las dimensiones potenciales de la celda unitaria y comparar las posiciones predichas de la señal de difracción con las reflexiones observadas. Selecciona la celda unitaria que mejor se ajuste a los datos y a la muestra.

Para construir modelos moleculares, se construyen arreglos 3D de los péptidos en una configuración de lámina beta que se ajuste a la celda unitaria determinada. Asegúrate de que todos los componentes relacionados con la simetría estén incluidos. A continuación, haz clic en Simulación de Difracción seguida de Estructuras y Generador de Cadenas de Estructuras y carga el modelo PDB.

Asigna el eje de la fibra y el eje de la viga, introduce las dimensiones de la celda unitaria y luego comprueba si hay choques estéricos. Navega a Simulación de Difracción y haz clic en Simulación de Difracción de Fibra para subir las coordenadas PDB al módulo de Simulación de Difracción de Fibra. Introduce la dirección del eje de la fibra, la orientación del haz, las dimensiones de la celda unitaria, la fuente de rayos X y los ajustes del detector, y luego haz clic en Simular para ejecutar la simulación.

Asegúrate de que el eje del haz sea perpendicular al eje de la fibra. Luego navega a Archivo y haz clic en Guardar como para guardar la configuración de simulación como archivos html para editarla después. Guarda el patrón simulado de difracción en formato RAW o como archivo TIFF.

Compara el patrón simulado con el patrón experimental de difracción. Mide señales simuladas de difracción usando el mismo flujo de trabajo de análisis. Registrar y comparar estos valores con datos experimentales.

Las micrografías electrónicas mostraron una alta densidad de fibrillas amiloides en la rejilla adecuadas para la preparación de una muestra de fibra de rayos X. Las fibras alineadas con armazón elástico producían un patrón característico de difracción cross-beta con una reflexión meridianal a 4,76 angstroms y reflexiones ecuatoriales derivadas de la longitud de la cadena, el espaciamiento de las láminas y el tamaño del protofilamento. Un patrón idealizado de difracción beta cruzada demostró que las reflexiones meridiales y ecuatoriales corresponden a espaciamientos repetitivos a lo largo de los ejes de las fibras.

Un patrón de difracción bien centrado era simétrico, con picos ecuatoriales y meridiales superpuestos en posición. Los picos de difracción se detectaron automáticamente y se listaron mediante análisis de búsqueda de picos. Los picos de difracción detectados se utilizaron para identificar dimensiones plausibles de la celda unitaria.

Se preparó un modelo estructural utilizando la celda unitaria identificada y se visualizó antes de la simulación de difracción. Los datos simulados de difracción generados a partir del modelo estructural propuesto mostraron una concordancia razonable con el patrón experimental de difracción tanto en posiciones de reflexión como en las intensidades relativas. Superponer patrones de difracción simulados y experimentales demostró además la alineación de las reflexiones correspondientes.

Un alineamiento adecuado de la muestra es fundamental porque determina la calidad de los datos de difracción y la información obtenida de ellos. Este trabajo permite la modelización estructural de resolución atómica e integración con otras técnicas estructurales, como la AFM, para posibilitar estructuras moleculares detalladas.