In vitro Reconstitución de la ubiquitinación bacteriana y eliminación mediada por VCP/p97

Nuestro trabajo revela cómo VCP o p97 actúa como defensor citosólico frente a múltiples patógenos diferentes. Esto desbloquea el potencial de VCP o p97 para aplicaciones terapéuticas y estrategias de bioingeniería. Además de la bioquímica rutinaria, se utilizan microscopía de superresolución, criomagnetometra, crioterapia extraterrestre para determinar cómo estos efectores del huésped se organizan sobre el patógeno para destruirlos.

Para empezar, cultivar la neumonía de estreptococo es seis cepas de serotipo dos durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en medio de levadura Todd Hewitt. Inocular una parte del cultivo nocturno en 10 partes de medio fresco de levadura Todd Hewitt e incubar a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,4. Luego mezclo 900 microlitros de cultivo de estreptococo para neumonía con 600 microlitros de glicerol al 50% y almacenamos el stock de glicerol a menos 80 grados Celsius.

Luego descongela un nuevo stock de pneumonía por estreptococo desde menos 80 grados Celsius y inocularlo completamente en cinco mililitros de medio de levadura Todd Hewitt. Toma aproximadamente 10 a la potencia de siete células de estreptococo neumonía. Para lavar bien las células, resuspende las bacterias en el tampón de reacción y centrifuga a 21.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Resuspende el pellet con un lisado de células de mamífero 549. Luego añade ubiquitina purificada y un milimolar de adenosina trifosfato e incuba la mezcla durante una o dos horas a 27 grados Celsius. Luego lava las bacterias una vez con un tampón de reacción que contiene una urea molar, seguido de dos lavados adicionales solo con el tampón de reacción.

Fija las bacterias con un 1% de paraformaldehído. Tras la fijación, incubar las células con PBS, que contenga un miligramo por mililitro de glicina durante 15 minutos. Luego lávate dos veces con PBS.

Prepara una mezcla de reacción combinando ubiquitina con otros componentes necesarios en el tampón de reacción. Ajusta el volumen total de la mezcla de reacción a 100 a 150 microlitros. Suspende de nuevo las bacterias en la mezcla de reacción que contiene la enzima ubiquitina e incuba la suspensión durante dos horas a 27 grados Celsius.

Después de lavar las bacterias tres veces con un tampón de reacción que contiene urea, fijarlas con paraformaldehído al 1%. Tras la fijación, incubar las células con PBS, que contenga un miligramo por mililitro de glicina durante 15 minutos. Luego incuba la muestra en 3% de BSA durante una hora a 27 grados Celsius, y lava la muestra dos veces con PBS.

Resuspende las bacterias ubiquitinadas en una solución primaria de anticuerpos, preparada a concentraciones más altas que las que normalmente se utilizan en ensayos de inmunofluorescencia. Luego incuba durante una hora a 27 grados Celsius. Después de lavar las bacterias dos veces con PBS, resuspenderlas en el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555.

Ahora se colan aproximadamente entre 10 y 20 microlitros de la muestra bacteriana etiquetada en una lámina de vidrio y se mezclan entre cinco y 10 microlitros de medio de montaje con o sin DAPI. Coloca una funda sobre la muestra y usa papel de seda para secar el exceso de líquido. Combinar seis micromolares VCP p97 con un micromolar NPLOC4 y un micromolar UFD-1.

Ajusta el volumen de la mezcla de reacción a aproximadamente 90 microlitros, usando tampón de reacción, e incuba sobre hielo durante dos horas. A continuación, añade uno o dos milimolares de adenosina trifosfato a la mezcla de reacción que contiene p97 UFD-1, NPLOC4. Luego combina esto con 10 a la potencia de siete células ubiquitinadas de estreptococo de neumonía, e incuba durante dos horas a 37 grados Celsius.

Inmediatamente después del tratamiento, toma una alícuota de 10 microlitros de la mezcla de reacción y realiza una dilución en serie. Coloca entre 10 y 20 microlitros de cada dilución en placas de infusión cerebral y cardíaca. Evalúa las unidades formadoras de colonias entre los puntos de hora cero y dos horas.

Calcula el porcentaje de viabilidad bacteriana dividiendo el recuento de UFC de dos horas por el recuento de UAC de cero horas y multiplicando por 100. Se observó una ubicuïtinación significativa de Streptococcus pneumoniae cuando se trató con lisado celular de mamíferos o con un sistema enzimático E-1, E-2, E-3 reconstituido. La señal de ubiquitinación estuvo ausente en el control y disminuyó notablemente cuando el estreptococo ubiquitinado de Estreptococcus pneumoniae se expuso a OTUB1, confirmando la modificación de poliubiquitina vinculada a K48.

Un análisis del perfil lineal mostró una superposición completa entre las señales de ubiquitina y bacterianas, confirmando su colocalización espacial. La reconstrucción tridimensional confirmó la superposición espacial de las señales de ubiquitina y estreptococcus pneumoniae. El tipo silvestre p97, combinado con sus cofactores, UFD1 y NPLOC4, redujo la viabilidad bacteriana al 10 al 20% tras dos horas, independientemente de si la ubiquitinación se realizaba con lisado celular o con sistema enzimático purificado.

No se observó una reducción en la viabilidad bacteriana cuando se omitía la ubiquitinación, cuando se inactivaba el p97 por calor o al usar el mutante catalíticamente inactivo p97, E57 8Q, lo que confirma que tanto la ubiquitinación como el p97 activo son esenciales para la eliminación bacteriana. Nuestro estudio abre la puerta sobre cómo las ligases de ubiquitina E3 del huésped modifican diferentes patógenos e investigan los mecanismos efectores para eliminar las amenazas infecciosas. A continuación, nuestro objetivo es explorar cómo se regula p97 o VCP y desarrollarlo para aumentar su actividad antibacteriana.