Name: Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende a realizar imágenes de células vivas para monitorizar la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis utilizando sondas fluorescentes como LysoTracker y perlas de dextrano.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development and diseases.</a> Genes Dev. 32, 327-340 (2018).</li>
<li>Kang, K., Park, C., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Necroptosis at a glance.</a> J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).</li>
<li>Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+pathways+of+apoptotic%2C+necroptotic%2C+pyroptotic%2C+and+ferroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death.</a> Mol Cell. 84, 170-179 (2024).</li>
<li>Zhang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3%2C+an+energy+metabolism+regulator+that+switches+TNF-induced+cell+death+from+apoptosis+to+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis.</a> Science. 325, 332-336 (2009).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Cho, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-driven+assembly+of+the+RIP1-RIP3+complex+regulates+programmed+necrosis+and+virus-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation.</a> Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+is+a+key+receptor+interacting+protein+3+downstream+component+of+TNF-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cell+death+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cell death at a glance.</a> J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).</li>
<li>Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+cell+death%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges.</a> Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).</li>
<li>Alu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lysosome+in+regulated+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">The role of lysosome in regulated necrosis.</a> Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).</li>
<li>Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1-associated+lysosomal+permeabilization+is+cathepsin+B+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).</li>
<li>Vanden Berghe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%2C+necrosis+and+secondary+necrosis+converge+on+similar+cellular+disintegration+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features.</a> Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+polymerization-induced+lysosomal+membrane+permeabilization+promotes+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis.</a> Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).</li>
<li>Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B+knockout+mice+are+resistant+to+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+hepatocyte+apoptosis+and+liver+injury%3A+implications+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications.</a> Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+quantification+of+lysosomal+membrane+permeabilization%3A+a+hallmark+of+lysosomal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death.</a> Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).</li>
<li>Barral, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+to+analyze+lysosome+morphology%2C+positioning%2C+motility+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function.</a> Traffic. 23, 238-269 (2022).</li>
<li>Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+detecting+lysosome+quantity+and+membrane+permeability+in+acute+myeloid+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines.</a> STAR Protoc. 5, 103309(2024).</li>
<li>Ferrari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+quality+control+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases.</a> Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).</li>
<li>Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+stress+in+cardiovascular+diseases%3A+therapeutic+potential+of+cardiovascular+drugs+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions.</a> Biomedicines. 13, (2025).</li>
<li>Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lysosomes+in+human+disease%3A+from+basic+research+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).</li>
<li>Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).</li>
<li>Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+phosphatase+PGAM5+functions+at+the+convergence+point+of+multiple+necrotic+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways.</a> Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).</li>
<li>Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+live-cell+fluorescence+imaging+conditions+to+minimize+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity.</a> J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).</li>
<li>Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+lysosomal+membrane+permeabilization+using+acridine+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange.</a> Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).</li>
<li>Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+selective+elimination+of+damaged+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes.</a> Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Celdas HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Células del cáncer de colon</td></tr><tr><td>Plato de fondo de cristal de 35 mm</td><td>Corporación MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocal</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas verdes Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, fluoresceína, 10.000 MW, aniónica, lisina fijable</td></tr><tr><td>Eagle Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rojo DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Tipo HF de inmersión en aceite</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina (P/S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Smac mimético (S)</td><td>BV6, ApexBio, Catálogo</td><td>B4653</td><td>Concentración final, 1 mM</td></tr><tr><td>El Ladrillo y la Piedra;</td><td>Servicios de imagen de la vida</td><td>13685</td><td>Controlador de CO2 del mezclador de gases</td></tr><tr><td>El Cubo</td><td>Servicios de imagen de la vida</td><td>CBO2A</td><td>Microscopios de cámara de control de temperatura</td></tr><tr><td>Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-&alfa; - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Concentración final, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Concentración final, 20 mM</td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

Los procedimientos descritos en este protocolo permiten la adquisición de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal para monitorizar la LMP en tiempo real. La Figura 1 ilustra una representación esquemática del protocolo experimental, desde la siembra celular hasta la adquisición de imágenes. En el día 0, se sembraron 5.000 células HT-29 y se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2. Después de 24 h (día 1), las células se incubaron con perlas de dextrano marcadas con fluoresceína (25 μg / mL) durante 24 h adicionales en las mismas condiciones. Estas perlas se internalizan por endocitosis y se trafican a los lisosomas, donde se acumulan y aparecen como puntos brillantes. El día 2 (día del experimento), las células se trataron con colorante LysoTracker sensible al pH (1 μM) durante 2 h a 37 °C y 5% de CO2. LysoTracker concentra y exhibe una fuerte fluorescencia dentro de compartimentos ácidos, como endosomas tardíos y lisosomas. Treinta minutos antes de la obtención de imágenes, el sistema de microscopio confocal se encendió y estabilizó, incluidos los controladores de temperatura, gas y humedad, como se describe en el paso 4 del protocolo. Se ensambló la cámara de imágenes, como se muestra en la Figura 2. Se utilizaron los láseres de 488 nm (verde) y 555 nm (rojo).
Después de la incubación con LysoTracker, las células se lavaron cuidadosamente tres veces con PBS y se agregaron 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S. La placa se transfirió al microscopio y se aplicó una gota de aceite de inmersión en el objetivo de inmersión en aceite 63x/1.40 NA. La intensidad del láser y los niveles de fondo se ajustaron para optimizar las condiciones de imagen, como se describe en el paso 5.5. del protocolo. Nuestras imágenes iniciales confirmaron la presencia de puntos estables del Lysotracker y dextrano marcado con fluoresceína, lo que indica lisosomas intactos (Figura 3). Las imágenes de referencia se adquirieron antes de T/S/Z y se utilizaron como control. No se aplicó ningún vehículo.
Después de establecer la configuración inicial de imágenes y microscopía, la placa se devolvió a la campana de flujo laminar y se agregó 1 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de P / S, que contenía 100 ng / ml de TNF-α (T), 500 nM mimético SMAC (S) y 100 μM Z-VAD-FMK (Z). Las imágenes continuaron en el microscopio confocal utilizando el parámetro de adquisición de imágenes descrito en el paso 6 del protocolo. Como se muestra en la Figura 3, película complementaria S1 y película complementaria S2, la disminución progresiva de la fluorescencia de LysoTracker en células tratadas con T / S / Z sirvió como un indicador temprano del cambio lisosomal. Esta pérdida fue seguida por la salida de dextrano marcado con fluoresceína de los lisosomas al citosol (desplazamiento de punteado a difuso), lo que indica FUM. A las 8 h, casi toda la señal de Lysotracker desapareció, sin embargo, muchas células aún conservaban puntos verdes con señal verde citosólica, lo que sugiere que la pérdida del gradiente de pH lisosomal precede a la liberación completa de LMP y carga.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Representación esquemática del protocolo experimental. (Creado en BioRender.com) Inicialmente, se sembraron 5.000 células (0 h) y se incubaron durante 24 h; después de eso, se agregaron perlas de dextrano (25 μg / ml) y se incubaron durante 24 h adicionales. A las 48 h, se agregó LysoTracker (1 μM) y se incubó durante 2 h. Las células se lavaron tres veces con PBS (paso 1), seguido de la adición de 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S (paso 2). Se ajustaron los ajustes de microscopía (paso 3) y las células se trataron con TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMZ (Z) (paso 4), antes de la adquisición de imágenes de células vivas (paso 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Diagrama de la configuración de la cámara de imágenes. (A) El portamuestras, (B) la cámara de incubación de gas y (C) la tapa superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Imágenes representativas de las células HT29 antes y después del tratamiento T/S/Z. Las células se tiñeron con perlas rojas de Lysotracker y verde de dextrano y se trataron con TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMZ (Z). Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película complementaria S1: Lapso de tiempo de células HT29 incubadas con perlas verdes de dextrano y tratadas con T / S / Z. Las células fueron monitoreadas durante más de 6 h para evaluar la respuesta celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película complementaria S2: Lapso de tiempo de células HT29 incubadas con rojo LysoTracker y tratadas con T / S / Z. Las células fueron monitoreadas durante más de 6 h para evaluar la respuesta celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Necroptosis, a form of regulated necrosis, culminates in cell membrane rupture. Our lab and others have discovered that lysosomal membrane ...

live-cell-imaging-lysosomal-membrane-permeabilization-during

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con...

Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca 2 +, esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.

Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

La inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS2a es una poderosa herramienta para estudiar el daño espaciotemporal de vesículas intracelulares (IV) en células vivas.

Un enfoque fotodinámico para estudiar la función de la ruptura de vesículas intracelulares

La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

Este protocolo describe un mecanismo para utilizar la microscopía óptica y electrónica correlativa para visualizar la interacción de mitocondrias y lisosomas marcados con mEosEM y APEX2, respectivamente.

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Aprende a realizar imágenes de células vivas para monitorizar la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis utilizando sondas fluorescentes como LysoTracker y perlas de dextrano.

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Explorar más videos