Name: Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende a realizar imágenes de células vivas para monitorizar la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis utilizando sondas fluorescentes como LysoTracker y perlas de dextrano.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Celdas HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Células del cáncer de colon</td></tr><tr><td>Plato de fondo de cristal de 35 mm</td><td>Corporación MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocal</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas verdes Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, fluoresceína, 10.000 MW, aniónica, lisina fijable</td></tr><tr><td>Eagle Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rojo DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Tipo HF de inmersión en aceite</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina (P/S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Smac mimético (S)</td><td>BV6, ApexBio, Catálogo</td><td>B4653</td><td>Concentración final, 1 mM</td></tr><tr><td>El Ladrillo y la Piedra;</td><td>Servicios de imagen de la vida</td><td>13685</td><td>Controlador de CO2 del mezclador de gases</td></tr><tr><td>El Cubo</td><td>Servicios de imagen de la vida</td><td>CBO2A</td><td>Microscopios de cámara de control de temperatura</td></tr><tr><td>Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-&alfa; - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Concentración final, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Concentración final, 20 mM</td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

Los procedimientos descritos en este protocolo permiten la adquisición de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal para monitorizar la LMP en tiempo real. La Figura 1 ilustra una representación esquemática del protocolo experimental, desde la siembra celular hasta la adquisición de imágenes. En el día 0, se sembraron 5.000 células HT-29 y se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2. Después de 24 h (día 1), las células se incubaron con perlas de dextrano marcadas con fluoresceína (25 μg / mL) durante 24 h adicionales en las mismas condiciones. Estas perlas se internalizan por endocitosis y se trafican a los lisosomas, donde se acumulan y aparecen como puntos brillantes. El día 2 (día del experimento), las células se trataron con colorante LysoTracker sensible al pH (1 μM) durante 2 h a 37 °C y 5% de CO2. LysoTracker concentra y exhibe una fuerte fluorescencia dentro de compartimentos ácidos, como endosomas tardíos y lisosomas. Treinta minutos antes de la obtención de imágenes, el sistema de microscopio confocal se encendió y estabilizó, incluidos los controladores de temperatura, gas y humedad, como se describe en el paso 4 del protocolo. Se ensambló la cámara de imágenes, como se muestra en la Figura 2. Se utilizaron los láseres de 488 nm (verde) y 555 nm (rojo).
Después de la incubación con LysoTracker, las células se lavaron cuidadosamente tres veces con PBS y se agregaron 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S. La placa se transfirió al microscopio y se aplicó una gota de aceite de inmersión en el objetivo de inmersión en aceite 63x/1.40 NA. La intensidad del láser y los niveles de fondo se ajustaron para optimizar las condiciones de imagen, como se describe en el paso 5.5. del protocolo. Nuestras imágenes iniciales confirmaron la presencia de puntos estables del Lysotracker y dextrano marcado con fluoresceína, lo que indica lisosomas intactos (Figura 3). Las imágenes de referencia se adquirieron antes de T/S/Z y se utilizaron como control. No se aplicó ningún vehículo.
Después de establecer la configuración inicial de imágenes y microscopía, la placa se devolvió a la campana de flujo laminar y se agregó 1 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de P / S, que contenía 100 ng / ml de TNF-α (T), 500 nM mimético SMAC (S) y 100 μM Z-VAD-FMK (Z). Las imágenes continuaron en el microscopio confocal utilizando el parámetro de adquisición de imágenes descrito en el paso 6 del protocolo. Como se muestra en la Figura 3, película complementaria S1 y película complementaria S2, la disminución progresiva de la fluorescencia de LysoTracker en células tratadas con T / S / Z sirvió como un indicador temprano del cambio lisosomal. Esta pérdida fue seguida por la salida de dextrano marcado con fluoresceína de los lisosomas al citosol (desplazamiento de punteado a difuso), lo que indica FUM. A las 8 h, casi toda la señal de Lysotracker desapareció, sin embargo, muchas células aún conservaban puntos verdes con señal verde citosólica, lo que sugiere que la pérdida del gradiente de pH lisosomal precede a la liberación completa de LMP y carga.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Representación esquemática del protocolo experimental. (Creado en BioRender.com) Inicialmente, se sembraron 5.000 células (0 h) y se incubaron durante 24 h; después de eso, se agregaron perlas de dextrano (25 μg / ml) y se incubaron durante 24 h adicionales. A las 48 h, se agregó LysoTracker (1 μM) y se incubó durante 2 h. Las células se lavaron tres veces con PBS (paso 1), seguido de la adición de 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S (paso 2). Se ajustaron los ajustes de microscopía (paso 3) y las células se trataron con TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMZ (Z) (paso 4), antes de la adquisición de imágenes de células vivas (paso 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Diagrama de la configuración de la cámara de imágenes. (A) El portamuestras, (B) la cámara de incubación de gas y (C) la tapa superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Imágenes representativas de las células HT29 antes y después del tratamiento T/S/Z. Las células se tiñeron con perlas rojas de Lysotracker y verde de dextrano y se trataron con TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMZ (Z). Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película complementaria S1: Lapso de tiempo de células HT29 incubadas con perlas verdes de dextrano y tratadas con T / S / Z. Las células fueron monitoreadas durante más de 6 h para evaluar la respuesta celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película complementaria S2: Lapso de tiempo de células HT29 incubadas con rojo LysoTracker y tratadas con T / S / Z. Las células fueron monitoreadas durante más de 6 h para evaluar la respuesta celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

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Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Aprende a realizar imágenes de células vivas para monitorizar la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis utilizando sondas fluorescentes como LysoTracker y perlas de dextrano.

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

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