Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Este protocolo describe un método de imagen de células vivas para monitorizar la permeabolización de la membrana lisosomal durante la necroptosis utilizando sondas fluorescentes que detectan cambios en la integridad y acidificación de la membrana lisosomal. El reto en el campo es caracterizar la dinámica de los orgánulos dañados durante el proceso de muerte celular y definir con precisión cómo este daño debe impulsar o contribuir a la muerte celular. Para empezar, emplastre 5.000 células en dos mililitros de medios DMEM suplementados con antibióticos en una placa estéril con fondo de cristal.

Coloca el plato en una incubadora a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono e incuba las células durante la noche. Añade 20 microlitros de perlas verdes de dextrano a 25 microgramos por mililitro en medios frescos de DMEM suplementados con antibióticos para diluirlos. Retira el medio viejo del plato y retitúyelo por dos mililitros de medio DMEM suplementado que contenga ternera.

Coloca el plato en una incubadora a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono, e incuba durante 24 horas para permitir la internalización de las perlas en lisosomas. Ahora añade dos microlitros de una solución de stock LysoTracker milimolar a dos mililitros de medio DMEM fresco. Sustituye el medio antiguo por esta solución de tinción.

Incubar las células a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Activa los componentes del sistema confocal encendiendo el ordenador personal, el microscopio, la alimentación del escáner, la potencia del láser, la emisión láser y la alimentación Leica. Activa los controles ambientales, incluido el controlador de temperatura, llamado Cube, y el controlador mezclador de gas dióxido de carbono, llamado Brick.

Abre el suministro de dióxido de carbono y osígeno. Pon el controlador de temperatura a 37 grados Celsius. Configura el controlador de gas y humedad al 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad.

Monta la cámara de imagen. Después de teñir, lava las células tres veces con dos mililitros de PBS y luego añade dos mililitros de medio DMEM fresco suplementado. Aplica aceite de inmersión sobre la lente objetivo antes de hacer la imagen.

Monta el plato en el escenario del microscopio. Ajusta la intensidad del láser hasta el 3% pero no más del 5%. Luego ajusta la ganancia del detector en el software del microscopio para optimizar la señal. Minimiza el fondo ajustando la barra de contraste.

Adquirir imágenes basales de células no tratadas, que sirven como condición de control. Devuelve la placa a la campana de flujo laminar y añade un mililitro de antibiótico DMEM suplementado con inductores de muerte celular. En el software de adquisición, configura el modo en XYT, formatea en 512 por 512, velocidad en 400, zoom a tres, media de línea a uno, acumulación de líneas a tres, acumulación de fotogramas a uno, intervalo de tiempo a tres minutos, duración a ocho horas y activa el enfoque automático.

Haz clic en iniciar para comenzar la adquisición en tiempo de tiempo. Las imágenes iniciales confirmaron la presencia de puntos estables de LysoTracker y dextran marcado con fluoresceína, indicando lisosomas intactos antes del tratamiento. Cuatro horas después del tratamiento con TSZ, la fluorescencia de LyoTracker se redujo notablemente, mientras que dextrán comenzó a mostrar una distribución citosólica difusa, indicando permeabilización inicial de la membrana lisosomal.

Ocho horas después del tratamiento, la señal de LysoTracker había desaparecido casi por completo, mientras que muchas células conservaban puntos de dextrano verde con señal citosólica verde difusa. Demostramos que la permeabolización de la membrana lisosomal puede visualizarse directamente en una célula viva sometida a inducción necroptótica. Este protocolo demuestra que la combinación de las perlas LysoTracker y dextran permite monitorizar simultáneamente el pH lisosomal y la liberación de carga en tiempo real.

Y es importante para avanzar en este protocolo de imagen de células vivas su capacidad para monitorizar en tiempo real un pequeño cambio de pH y la permeabilización de la membrana lisosomal, capturando eventos dinámicos que pasan por alto en el análisis de puntos finales como la citometría de flujo y la tinción de una sola capa.