Name: Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda métodos bioquímicos para caracterizar GFAP y sus mutaciones asociadas a la enfermedad de Alexander. Este protocolo permite estudiar el ensamblaje de filamentos y modificaciones postraduccionales en astrocitos.

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<table><tbody><tr><td>Solución 30% de acrilamida/Bis 37,5:1</td><td>Biorad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>USB</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFAP</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ubiquitina</td><td>Millipore</td><td>ST 1200</td><td>Clon de FK2</td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-26S XP</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroanfenicol</td><td>USB</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-Sephrose</td><td>Cytiva</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul Coomassie</td><td>USB</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla de cobre</td><td>Ted Pella</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX Micro ultracentrfuga</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de dounce</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>UR</td><td>DTT</td><td></td></tr><tr><td>Cepa pLysS de E. coli BL21(DE3)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasiGlow</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL 105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>Columna S de HiRes</td><td>Cytiva</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>Columna Q de HiTrap</td><td>Cytiva</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (LB Agar)</td><td>USB</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>Medio LB (LB Broth)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Honeywell</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía NGC</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenamemina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S55S Rotor</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S80AT3 Rotor</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>USB</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520 cabras anti-ratón IgG&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700 cabra anti-conejo IgG&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>USB</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión H-7700)</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Ciencias del microscopio electrónico &nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Honeywell</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

Para investigar cómo las mutaciones causantes de AxD afectan a las propiedades de ensamblaje de GFAP, producimos proteínas recombinantes en bacterias utilizando un sistema de expresión basado en PET. Detallamos los protocolos para expresar y purificar GFAP, usando WT GFAP como ejemplo. Tras la inducción del IPTG (Figura 1A, carril 2), el GFAP se purificó mediante un proceso de tres pasos que incluyó la preparación del cuerpo de inclusión (Figura 1B) y cromatogra...

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) is a key intermediate filament protein critical for maintaining the structural integrity and function of astrocytes ...

experimental-approaches-for-biochemical-analysis-glial-fibrillary

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.

Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Utilizando microscopía de fuerza atómica en combinación con la tecnología de biopanning, creamos un sistema de biopanning negativo y positivo para adquirir anticuerpos contra variantes de proteínas específicas de enfermedades presentes en cualquier material biológico, incluso a bajas concentraciones.  Tuvimos éxito en la obtención de anticuerpos contra las variantes de la proteína TDP-43 implicadas en la esclerosis lateral amiotrófica.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Se describe una ELISA que ofrece un enfoque cuantitativo novedoso. Detecta específicamente alfa-sinucleína asociada a la enfermedad (αSD) en un modelo de ratón transgénico (M83) de sinucleinopatía utilizando varios anticuerpos contra la forma de alfa-sinucleína fosforilada en Ser129 o la parte C-terminal de la proteína.

La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez más insoluble/agregada a partir de tejido cerebral humano post-mortem. Mediante la utilización de tampones con una fuerza detergente creciente y técnicas de ultracentrifugación de alta velocidad, se pueden examinar las propiedades variables de la agregación α-syn en tejidos enfermos y no enfermos.

Extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos

Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.

Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de inmunofluorescencia indirecta de flotación libre en secciones de biopsia de piel que permite la identificación de variantes de conformación específicas de la enfermedad de la sinucleína alfa implicadas en la enfermedad de Parkinson y múltiples proteínas de la sistema nervioso periférico.

Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre

Este protocolo describe un método para rastrear trayectorias individuales de envejecimiento cerebral a través de un programa de donación cerebral y caracterización adecuada de cerebros. Los donantes cerebrales participan en un estudio longitudinal a largo plazo que incluye evaluaciones multidimensionales en serie. El protocolo contiene una descripción detallada del procesamiento cerebral y una metodología de diagnóstico precisa.

Protocolo del Banco Cerebral Abbiategrasso para Recopilar, Procesar y Caracterizar Cerebros De Envejecimiento

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Aprenda métodos bioquímicos para caracterizar GFAP y sus mutaciones asociadas a la enfermedad de Alexander. Este protocolo permite estudiar el ensamblaje de filamentos y modificaciones postraduccionales en astrocitos.

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades (Video) | JoVE Journal

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

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