Name: Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a purificar trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos mediante FACS para estudiar interacciones inmunológicas en la interfaz materno-fetal en embarazos sanos y patológicos.

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<ol><li>Papuchova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+that+have+distinct+immune+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).</li>
<li>Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+primary+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+and+HLA-G%2B+EVT-like+cell+lines+to+study+maternal-fetal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).</li>
<li>Tilburgs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts%3A+Immune-activating+cells+that+interact+with+decidual+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progestogen-driven+B7-H4+contributes+to+onco-fetal+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance.</a> Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+human+leucocyte+antigen-C+molecules+at+the+surface+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells.</a> Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Moffett, A., Loke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+placentation+in+eutherian+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of placentation in eutherian mammals.</a> Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).</li>
<li>Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+role+of+HLA-C+in+tolerance+and+immunity+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface.</a> Front Immunol. 10, 2730(2019).</li>
<li>Vander Zwan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+signature+of+activation+and+dysfunction+allows+human+decidual+CD8%2B+T+cells+to+provide+both+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).</li>
<li>Salvany-Celades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+functional+regulatory+T+cells+control+T+cell+responses+at+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface.</a> Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).</li>
<li>Mahajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+decidual+CD8%2B+T+cells+include+distinct+effector+memory+and+tissue-resident+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells.</a> JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).</li>
<li>Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KIR2DS1+by+decidual+natural+killer+cells+increases+their+ability+to+control+placental+HCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-eclampsia%3A+Pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications.</a> BMJ. 366, 12381(2019).</li>
<li>Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+T+cells+in+decidua+of+miscarriage+cases+with+abnormal+or+normal+fetal+chromosomal+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content.</a> J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+decidual+effector+regulatory+T+cells+increase+in+late+gestation+of+normal+pregnancy+but+not+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia.</a> Front Immunol. 9, 1934(2018).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+heterogeneity+in+gestational+age+and+preeclampsia+using+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing.</a> Front Immunol. 15, 1401738(2024).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+signatures+of+the+human+placenta+in+term+and+preterm+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition.</a> eLife. 8, e52004(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+developmental+deficiencies+in+placentation+and+decidualization+in+late-onset+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia.</a> Front Immunol. 14, 1142273(2023).</li>
<li>Morita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+repertoire+and+PD-1+expression+in+decidual+and+peripheral+CD8%2B+T+cells+reveals+distinct+immune+mechanisms+in+miscarriage+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia.</a> Front Immunol. 11, 1082(2020).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proportion+of+peripheral+blood+and+decidual+CD4%2B+CD25bright+regulatory+T+cells+in+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia.</a> Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).</li>
<li>Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+and+peripheral+blood+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+early+pregnancy+and+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion.</a> Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).</li>
<li>Shannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+assessment+of+primary+and+stem+cell-derived+human+trophoblast+organoids+as+placenta-modeling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms.</a> Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).</li>
<li>Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
<li>Okae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+trophoblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of human trophoblast stem cells.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+in+human+trophoblast+stem+cells+reveals+shared+and+distinct+aspects+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+stem+cell-based+organoid+models+of+the+human+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.</a> Nat Commun. 15 (1), 962(2024).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&nbsp;&deg;C freezer</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 5% CO2 Incubator</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C fridge</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &frac12;&rdquo; scissors</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Viability Staining Solution</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&nbsp;&deg;C freezer&nbsp;</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700, mouse, IgG1 k Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot Spectral Cell Sorter</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 biosafety cabinet</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 Mouse IgG1, &kappa; isotype Control&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation sieve</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CD1-1KT (mesh size 60)</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers 40&micro;m, 70&micro;m, 100&micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 Green Detection Reagent</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Curved tip tweezers</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF, Human, Recombinant, Animal Free</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin (1mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>magnet separator</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10X Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>Research grade FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542. 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath 37&nbsp;&deg;C</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x No Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza</td><td>04-380Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación de trofoblastos extravillosos hla-g+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

Rendimientos esperados de la celda
A partir de 15 mL de basal de la hoja de caduca, la EVT esperada de HLA-G+ da entre 0,1 y 0,3 × 106 células en la primera digestión y entre 0,1 y 0,6 × 106 celdas en la segunda digestión (total 0,2-0,8 × 106 células). A partir de 30 mL de membrana coriónica, los rendimientos esperados de EVT HLA-G+ son 0,4-1,0 × 106 células en la primera digestión y 0,4-1,5 × 106 células en la segunda digestión (total 0,8-2,5 × 106 células). Se espera que la proporción de caspasa 3/7-7-AAD-EVT viva en los aislados sea del 90-95%.
Cultura primaria de EVT HLA-G+ 
El análisis de citometría de flujo de marcadores de linaje (HLA-G, HLA-C, EGFR) y marcadores de muerte celular mostró que este protocolo proporciona un cultivo primario viable de EVT hasta el día 4 (96 horas después de colocar el EVT clasificado) (Figura 1B-D). Se muestran imágenes representativas de microscopía óptica de la TRV coriónica primaria y d.basalis HLA-G+ tras 24, 48 y 72 horas de cultivo (Figuras 2A-F).
Cocultivo de EVT primaria HLA-G+ con células T
Este protocolo mejoró la viabilidad de la EVT primaria 96 horas después del aislamiento de la placenta, una mejora respecto a nuestro informeanterior 1, 2 y 10. Por ello, permite el análisis de las respuestas de la EVT tras el co-cultivo con linfocitos preestimulados, lo que simula la inflamación aguda en la interfaz materno-fetal. EVT expresa HLA-C polimórfica así como moléculas coinhibitorias inmunosupresoras, como PD-L1, PD-L2, PVR (también conocido como CD155), B7H3 y HLA-E, según lo determinado por tinción por citometría de flujo extracelular (Figuras 3A, B). La EVT aumentó la expresión de HLA-C, así como de PD-L1, PD-L2 y HLA-E, pero no incrementó la expresión de PVR y B7H3 cuando se co-cultivó con linfocitos activados durante 72 horas según la sección 8 del protocolo (Figura 4A,B). Además, no se observó un aumento en la muerte por EVT, como se mostró en la 7AAD y la tinción de caspasa 3/7 (Figura 4C,D).
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. La estrategia de acceso para la clasificación de células EVT y la citometría de flujo se traza tras cultivar EVT ordenado. (A) La estrategia representativa de gating para clasificar la EVT de decidua basalis y la EVT coriónica. R1 es la puerta de celda viva en el gráfico de dispersión del lado delantero. R2 es la puerta para la exclusión de leucocitos CD45+. R3 es la puerta HLA-G+EGFR+EVT. R4 es el 7-AAD-caspasa 3/7- EVT en vivo. Aunque la compuerta R4 no es necesariamente necesaria para la clasificación, aquí se muestra para demostrar la viabilidad de la EVT primaria. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo de HLA-G+EGFR+EVT ordenados, tras 96 horas de cultivo in vitro. (C,D) Frecuencias de caspasa 3/7-7-AAD - EVT vivas durante el proceso de cultivo (día 0) y 96 horas de cultivo (día 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. La morfología de la EVT durante el cultivo in vitro . Imágenes representativas de microscopía óptica de la EVT coriónica tras (A) 24 h, (B) 48 h y (C) 72 h de cultivo y EVT de la base de la decidua después de (D) 24 h, (E) 48 h y (F) 72 h de cultivo. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Fenotipos inmunológicos de la EVT primaria. (A) Los gráficos de flujo representativos de HLAs y moléculas coinhibitorias en EVT primaria determinados por tinción de citometría de flujo extracelular (día 0). (B) Los diagramas de líneas emparejadas muestran MFI puro del control IgG y la tinción completa de cada marcador desde d. basalis EVT (azul) y EVT coriónica (verde) en el día 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Fenotipos inmunológicos de la EVT primaria con o sin linfocitos activados (día 4). (A) Gráficos de flujo representativos de EVT tras el cultivo de 72 horas (día 4) con o sin linfocitos de terceros activados. (B) Los gráficos de líneas emparejadas muestran IMF de EVT con o sin linfocitos de terceros activados. Las parcelas azules representan la EVT de la caja de cidua basal, y las parcelas verdes representan la EVT coriónica. (C) Gráficos representativos de citometría de flujo para caspasa 3/7-7-AAD-EVT viva con o sin linfocitos de terceros activados en el día 4. (D) Los diagramas lineales emparejados muestran frecuencias de caspasa 3/7-7-AAD-EVT en vivo con o sin linfocitos de terceros activados. Las parcelas azules representan la EVT de la caja de cidua basal, y las parcelas verdes representan la EVT coriónica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
Tabla 1. Reactivos clave para la disección y digestión de tejidos. Véasetambién 1,2,24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%201_final.xlsx" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2. Reactivos clave para el cultivo de EVT y el cocultivo con células T. Véasetambién 1,2,24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%202_v2_final.xlsx" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3. Anticuerpos y reactivos clave para la clasificación y el análisis de citometría de flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%203_final.xlsx" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

The human maternal-fetal interface represents a unique immunological environment where maternal immune cells and fetal extravilllous trophoblasts (EVT) ...

purification-hla-g-extravillous-trophoblasts-from-human-term

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas durante el desarrollo. Encontramos que las células madre hematopoyéticas (HSC), son generados y ampliado en la placenta en el único nichos microambientales. A continuación, describimos las técnicas experimentales necesarias para el aislamiento y la visualización de la CMH en la placenta del ratón.

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Se describe el uso de los anticuerpos monoclonales TG30 (CD9) y GCTM-2 para la detección combinada de antígenos de la superficie celular a través de la fluorescencia activada por la clasificación celular (FACS) para la identificación y enriquecimiento de células madre embrionarias humanas vivas (hESC) utilizando la selección positiva y también el uso de la selección negativa para purgar hESCs de una población de células mixtas.

Enriquecimiento Y Purga De Células Madre Embrionarias Humanas Por La Detección De Antígenos De Superficie Celular Utilizando Los Anticuerpos Monoclonales TG30 Y GCTM-2

En este trabajo se describe un protocolo para aislar y estudiar más a fondo los leucocitos infiltrantes de la decidua basalis y la decidua parietalis - la interfaz materno-fetal humana. Este protocolo mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y produce suficientes celdas viables para aplicaciones posteriores, como lo demuestra el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Este manuscrito presenta un modelo in vitro único de células de citotrofoblasto velloso humano inmunopurificadas cultivadas bajo hipoxia/reoxigenación. Este modelo es adecuado para estudiar los efectos protectores de tratamientos prometedores, como la melatonina, sobre las complicaciones del embarazo asociadas con el aumento del estrés oxidativo y la alteración de la función placentaria.

Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Este estudio presenta un protocolo para el tejido reversible claro, immunostaining, renderizado 3D y análisis de redes vasculares en las muestras de vellosidades de la placenta humana del orden de 1-2 mm3.

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

Este protocolo describe la preparación de explantaciones de tejido placentario humano cultivadas en una interfaz aire-líquido para el estudio de infecciones virales.

Ex vivo Cultivo de explantes placentarios humanos para el estudio de la transmisión viral a través de la interfaz materno-fetal

Aprende a purificar trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos mediante FACS para estudiar interacciones inmunológicas en la interfaz materno-fetal en embarazos sanos y patológicos.

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G⁺ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

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