Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G⁺ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

Este protocolo está diseñado para purificar los trofoblastos humanos primarios de tejidos placentarios humanos para estudiar sus propiedades funcionales e inmunológicas en embarazos sanos y bajo condiciones patológicas. Por tanto, este protocolo proporciona una plataforma reproducible para superar algunas limitaciones previas al trabajar con trofoblastos extravillosos humanos primarios, concretamente su viabilidad. Así que este protocolo está realmente optimizado para mejorar su viabilidad y pureza.

Para empezar, obtén una muestra de placenta humana. Coloca la placenta con el lado fetal hacia arriba para que el lugar de inserción del cordón sea visible. Despega manualmente el amnión de la membrana lateral hacia el sitio de inserción del cordón umbilical y quítalo.

Luego usa tijeras para cortar y desechar la amnión. Corta la membrana coriodecidual en tiras de dos pulgadas que empiezan desde la base de la placenta hacia arriba, manteniendo cada tira unida a la placenta. Coloca la tira de membrana coriodecidual sobre dos dedos, con el lado decidual hacia arriba.

Con un par de pinzas curvas estériles en la punta, raspa suavemente la decidua parietal materna del corión. Recoger la caducida parietal en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de PBS para aislamiento de linfocitos. Luego recoge la membrana coriónica en un tubo cónico separado de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de medio de lavado A. Con tijeras, corta la membrana coriónica dentro del tubo de 50 mililitros en piezas más pequeñas de dos milímetros cuadrados.

Descarta el medio de lavado A del tubo. Lava el pañuelo repetidamente con PBS hasta que el sobrenadante quede claro. Para la disección placentaria, coloca la placenta con el lado materno hacia arriba y elimina los coágulos sanguíneos.

Con tijeras estériles, corta trozos de placa basal de la placenta evitando zonas necróticas, calcificadas o isquémicas. Coloca la pieza de la basal de la decidua sobre los dedos con las vellosidades hacia arriba. Luego, utiliza tijeras para eliminar cuidadosamente las vellosidades y obtener una membrana de dos a tres milímetros con solo una fina capa de vellosidades.

Recoge el tejido de la base de la decidua en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de PBS. Luego pica el papel en trozos de menos de dos milímetros cuadrados. Después, descarta el PBS del tubo.

Lava la caducida basal repetidamente con PBS hasta que el sobrenadante esté limpio y sin sangre visible. Luego se dividen 15 mililitros de suspensión de tejido en dos tubos cónicos de 50 mililitros. Llena todos los tubos con PBS.

Centrifuga los tubos a 200G durante un minuto y vierte el sobrenadante. Añade 150 mililitros de cóctel de enzimas para digestión de tejidos calientes en una botella de cristal de 300 mililitros. Añade 30 mililitros de membrana coriónica a la botella.

Añade 20 mililitros de DMEM/F-20 tibio y 80 mililitros de cóctel de enzimas de digestión tijidal tibia en dos botellas de cristal separadas de 300 mililitros. Luego añade 7,5 mililitros de Decidua Basalis en cada botella. Incuba las botellas en baño maria.

Agita todos los biberones cada tres o cuatro minutos durante los 15 minutos de incubación. Tras la digestión, filtra el tejido a través de tamices metálicos con una malla de 40. Luego añade el medio B para enjuagar los pañuelos y disolver el material gelatinoso.

Transfiere el tejido no digerido de nuevo a las botellas de cristal y repite la digestión. Luego filtra las suspensiones de celda a través de un filtro de 100 micrómetros hacia tubos cónicos de 50 mililitros etiquetados. Mantén separadas las células de la primera y segunda digestión.

Luego centrifuga la suspensión de la celda a 650G durante ocho minutos. Descarta el sobrenadante. Combina pellets del mismo tipo de tejido y número de digestión en un solo tubo.

Luego complementa el volumen con el medio B hasta 25 mililitros. Añadir 12 mililitros de ficoll a cuatro tubos cónicos de 50 mililitros etiquetados con el tipo de tejido y el número de digestión. Coloca cuidadosamente la suspensión de celda sobre el ficol.

Luego centrifuga a 800G durante 20 minutos a temperatura ambiente sin romperse. Aspira cuidadosamente la capa celular en la interfaz del medio ficol y transfiere a tubos limpios y etiquetados. Luego llena los tubos con el medio B de lavado y centrifuga a 650 g durante ocho minutos y vuelve a suspender los pellets.

Coloque los pellets resuspendidos en tubos de clasificación celulares estériles activados por fluorescencia, etiquetados con el tipo de tejido y el número de digestión. Añade anticuerpos anti-CD45 BV785, anti-HLA GAPC y anti-EGFR1 BV711. Incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Después de lavar y volver a suspender las células en el medio de lavado B, pásalas inmediatamente por un colador de celdas de 40 micrómetros. Clasificar trofoblastos extravillosos positivos positivo en HLAG CD45 en tubos que contienen un medio de cultivo EVT de medio A. El análisis de citometría de flujo de marcadores de linaje mostró un cultivo primario viable de trofoblastos extravillosos hasta el día cuatro. Se capturaron imágenes representativas de microscopía óptica de trofoblastos extravillosos positivos en el HLAG coriónico primario y la base de la decidua basal tras 24 horas, 48 horas y 72 horas de cultivo.

Extravillosas moléculas HLAC polimórficas y coinhibidoras inmunosupresoras, expresadas por trofoblasto. El trofoblasto extravilloso aumentó la expresión de HLAC, PD-L1, PD-L2 y HLA-E, pero no incrementó la expresión de PVR y B7H3 cuando se cocultivó con linfocitos activados durante 72 horas. No se observó un aumento en la muerte por trofoblastos extravillosos tras el cocultivo con linfocitos activados.

Así que este protocolo permite a las personas, a los científicos, utilizar trofoblastos extravillosos primarios para una amplia variedad de ensayos. El beneficio es la alta viabilidad que permite el análisis usando cultivo celular, cultivo en frío, citometría de flujo, proteómica y transcriptómica, utilizando estos trofoblastos extravillosos de alto rendimiento y muy viables. Uno de los aspectos más importantes de nuestro protocolo es que hay que utilizar materiales frescos para placenta.

No se pueden refrigerar. A los trofoblastos les encanta morir, así que por favor consigue los tejidos placentarios lo antes posible después del parto, preferiblemente dentro de las dos horas posteriores, y mantenlos a temperatura ambiente en todo momento. Esto es crucial para obtener un trofoblasto extraviloso altamente viable.

Así que algunos de los métodos más adicionales e innovadores que puedes usar con estos trofoblastos primarios son el cultivo celular a largo plazo. Así que puedes usarlos para establecer cultivos celulares primarios de cuatro días. Así que las células pueden ser viables hasta 96 horas, que es bastante tiempo y permite hacer cultivos en frío con células inmunitarias, como células T y células NK.

La otra innovación es que se pueden usar para establecer líneas celulares similares a trofoblastos usando los métodos descritos primero por Aoki, y que también usamos para aplicar en estos cultivos para establecer tipos celulares proliferantes a largo plazo que se pueden usar para la edición genómica y otros ensayos de cultivo a largo plazo. Así que usando estos métodos innovadores, incluido el cultivo celular a largo plazo, creo que puede ayudarte mucho a diseñar cultivos mecanicistas a largo plazo donde puedas aplicar edición genómica, knock-out, knock-in genes, proteínas, sobreexpresar algunos de estos trofoblastos para obtener mucho más detalle mecanicista sobre cómo estos trofoblastos imponen tolerancia, o permiten inmunidad y más citotoxicidad cuando interactúan con poblaciones inmunes.