Desarrollo de un novedoso modelo de fijación interna para fracturas radiales de rata: evaluación de la cicatrización de fracturas y aislamiento de ganglios de la raíz dorsal

Las fracturas radiales son muy prevalentes a nivel mundial y una de las principales causas de fracturas del hueso largo de las extremidades. El modelo de fractura radial en ratas es fundamental para estudiar la cicatrización de fracturas, el cribado de fármacos y la evaluación de biomateriales en la investigación ortopédica. Como el radio de las ratas es relativamente delgado, las placas y tornillos de acero que se usan actualmente en la práctica clínica no son adecuados para el tratamiento de fracturas radiales en ratas.

Para superar esta limitación, el protocolo combina de forma innovadora sutura y fijación con aguja de titanio, estableciendo un modelo estable de fractura radial para la investigación de fijación interna. En el protocolo, también presentamos el uso del sistema de microimagen de micro-TC para animales vivos para aclarar la cicatrización de fracturas en ratas. También mostramos la extracción y cultivo de la DRG en el modelo de fractura de rata, que se utilizará para estudiar el mecanismo de la lesión nerviosa y la reparación en fracturas.

Los instrumentos quirúrgicos para fracturas de rata incluyen bisturí, mango de bisturí, tijeras quirúrgicas, portaagujas, pinzas hemostáticas y pinzas de tejido dentado. El macho de rata Sprague Dawley, aproximadamente 8 semanas de edad y un peso de unos 200 gramos. Anestesiar a la rata con una máquina de anestesia con gas isoflurano y mantener la anestesia ventilatoria durante todo el procedimiento quirúrgico.

Mantén la temperatura del quirófano en 28 °C. Coloca la rata en posición lateral. Expone la extremidad anterior derecha y afeita el pelo con una máquina de cortar. Coloca una sábana estéril y envuelve un torniquete alrededor del miembro anterior proximal derecho para reducir el sangrado quirúrgico.

Prepara la piel alternando alcohol y exfoliantes de betadine tres veces. Realiza una incisión longitudinal de 1,5 cm en el lado radial dorsal del antebrazo derecho. Separa los espacios musculares y expone completamente el radio derecho de la extremidad anterior.

Utiliza tijeras de operación para cortar el radio y crear una fractura transversal. La dirección de las tijeras forma un ángulo de 90 grados respecto al radio. Toma una aguja de titanio de 0,8 mm de diámetro y 10 mm de largo, e insértala en la fractura radial a lo largo de su eje longitudinal.

Fija el radio y la aguja de titanio con sutura. La sutura se ataba con tres nudos consecutivos, y la aguja de titanio se aseguraba al radio mediante cuatro suturas interrumpidas. Sutura el color de piel del exceso de sutura y cierra la madera.

Desinfecta la piel con exfoliantes betadina. Cubre la herida con gasas estérils y sujeciónala con vendas. La rata recuperó la conciencia tras la anestesia y su estado se recuperó bien.

Anestesiar a la rata usando una máquina de anestesia con gas isoflurano. Coloca a la rata en posición prona dentro de la cámara de escaneo. Ajusta la posición de la extremidad y la cabeza para centrar el área de escaneo objetivo en el campo de visión y mantén la ventilación y anestesia continuas durante todo el procedimiento.

Empuja la cama fija para animales dentro de la cámara de escaneo y cierra la puerta de la cámara. Los parámetros de escaneo micro-CT se establecieron de la siguiente manera: modo de escaneo: estándar, tiempo de exposición: dos minutos, campo de visión: 72 mm, tamaño del vóxel: 144 m, kilovoltios: 90; micro-amperios: 88, filtro: 3D-soft. Los datos de escaneo se transmiten automáticamente al software y se genera una imagen TC tridimensional.

Separa los tejidos objetivo. Exporta las imágenes procesadas. Secciona la columna vertebral, elimina los cuerpos vertebrales de C1 a C7.

Corta la columna cervical a lo largo de las líneas medias anterior y posterior, divididas en mitades izquierda y derecha. Utiliza pinzas de tejido dentado para recoger la DRG, levántala suavemente y luego usa tijeras quirúrgicas para cortar las fibras nerviosas. Transfiere los DRG extraídos a un tubo centrífuga de 1,5 mL con medio de extracción.

Colocarlo en hielo. Aspira lentamente y desecha el medio de extracción. Añade 1 mL de solución mixta digestiva y enzimática activa.

Digiérrela en un baño maria a 37 °C durante 60 a 70 minutos. Pipetea la cantidad adecuada de la solución activa de fibronectina en una placa de Petri y recubrila en una incubadora a 37 °C durante una hora. Después de la digestión, aspira y descarta la solución mixta de enzimas digestivas que funcionan.

Recoge filtrado, centrifuga a 70 x g durante 8,5 minutos. Tras la centrifugación, aspira y descarta el sobrenadante en el tubo de la centrífuga. Añade 1 mL de medio completo para resuspender el precipitado.

Saca la placa de Petri. Descarta la solución activa de fibronectina y lávate con PBS dos veces. Inocúla las células en una placa de Petri y añade 1 mL de medio completo.

Colócalos en una incubadora a temperatura constante a 37 ºC con 5% de dióxido de carbono durante 8-12 horas. La micro-TC confirmó el establecimiento exitoso de modelos de ratas de fractura radial y de un modelo de fijación interna para fracturas radiales en ratas. 20 días después de la modelización, el análisis micro-TC de ratas SD en el grupo modelo de fracturas reveló un pronóstico favorable.

Se observó la formación de callos que cruza los extremos de la fractura, con fusión progresiva y obliteración gradual de la línea de fractura, lo cual es consistente con la fase inicial de unión ósea. Las imágenes mostraron una línea de fractura borrosa en la región modelada, lo que sugiere que el tejido óseo en el lugar de la fractura se había curado en gran medida. En el quinto o sexto día tras el aislamiento de DRG, las células neuronales presentan una exposición citoplasmática extensa.

En esta etapa, todo el cuerpo celular neuronal y sus sinapsis circundantes son claramente distinguibles. Se utilizó microscopía de inmunofluorescencia para fotografiar células neuronales en el sexto día de cultivo. Como se muestra en la Figura 9, la Beta III-tubulina se mostró como fluorescencia verde.

Las células positivas a beta-III-tubulina, incluyendo tanto cuerpos celulares como axones de DRG, fueron teñidas de verde, y la fluorescencia azul representa los núcleos de las neuronas teñidas por DAPI. Las ratas son un modelo clásico para estudiar el mecanismo de curación de fracturas debido a su claro trasfondo genético y su corto ciclo reproductivo. Sin embargo, el pequeño diámetro del radio, de unos 1-1,5 mm, hace imposible igualar un dispositivo de fijación interna de grado clínico, lo que limita severamente su utilidad en la investigación de la cicatrización nerviosa-hueso.

En respuesta a este problema, este estudio propuso de forma innovadora el método de fijación interna de sutura combinada con aguja de titanio. La lógica central es sustituir la fijación rígida de los tornillos por la ligadura flexible de suturas, que podría reducir la lesión nerviosa iatrogénica y proporcionar un entorno mecánico estable. Este protocolo proporcionaba repetibilidad y estandarización para la construcción del modelo.

Las suturas y las agujas de titanio se utilizan para la fijación interna en modelos de fractura radial en ratas. La cicatrización de fracturas se evalúa mediante micro-TC. Las neuronas primarias de la DRG se aíslan y cultivan tras los exámenes de cicatrización de fracturas.

En el protocolo, combinamos de forma innovadora suturas y agujas de titanio para una fijación interna estable en el modelo de fractura radial en rata. La cicatrización de fracturas se evaluó mediante micro-TC, y se aislaron y cultivaron neuronas primarias de DRG para su investigación adicional.