Name: Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende un protocolo optimizado de CRISPR-Cas9 en células CAR T humanas primarias. Este método mejora la recuperación de cassettes sgRNA mediante digestión enzimática y captura selectiva, facilitando la identificación de reguladores genéticos para potenciar terapias de inmunoterapia.

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<li>Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+biotinylated+RNA+or+DNA+pulldown+assays+for+detection+of+binding+proteins%3A+Examples+of+IRP1%2C+IRP2%2C+HuR%2C+AUF1%2C+and+Nrf2%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>4200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2991A</td><td></td></tr><tr><td>Naranja acridina</td><td>Invitrogen</td><td>A1301</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Separador NEO autoMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-120-327</td><td>Clasificador de celdas magnéticas de alta velocidad</td></tr><tr><td>Oligos biotinilados</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celolas fluorescentes K2</td><td>Revvity</td><td>CMT-K2-MX-150</td><td>Contador de células fluorescentes</td></tr><tr><td>Cámaras de conteo CHT4</td><td>Revvity</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Nanoperlas CD4 de CytoSinct</td><td>GenScript</td><td>L00863-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoperlas CD8 de CytoSinct</td><td>GenScript</td><td>L00864-1</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Agilent</td><td>200418-51</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador ExPERT ATX</td><td>MaxCyte</td><td>ExPERT ATx</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Cytiva</td><td>17544203</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 y micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83,18,26,001</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-Research</td><td>GenScript</td><td>Z03621-1</td><td></td></tr><tr><td>Herculase Buffer 5X</td><td>Agilent</td><td>600675-52</td><td>Búfer 5X</td></tr><tr><td>Enzima de fusión Herculasa II</td><td>Agilent</td><td>600679-51</td><td>ADN polimerasa</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-362</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler X50a</td><td>Eppendorf</td><td>6313HG006059</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de electroporación MaxCyte</td><td>Cytiva</td><td>EPB1</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Tejido nucleoespín</td><td>Macherey-Nagel</td><td>74,09,52,250</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-6</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propendio yodo</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>PspXI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0656S</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubit 3.0</td><td>Invitrogen</td><td>P33216</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de ADN de qubit HS</td><td>Invitrogen</td><td>P32851</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de procesamiento de pozo estéril R-50x3</td><td>MaxCyte</td><td>LM243882</td><td></td></tr><tr><td>Células T TransAct humanos</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-160</td><td>Reactivo de estimulación de células T</td></tr><tr><td>Estación de cinta HSD1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TEXMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-196</td><td>Medio de crecimiento de células T</td></tr><tr><td>Tris Buffer, 1,0 M, pH 8,0, grado de biología molecular</td><td>EMD Milipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>Agua, para biología molecular, DNAsa, RNAsa y proteasa libres</td><td>ThermoScientific</td><td>327390010</td><td></td></tr></tbody></table>

mejorando las pantallas crispr-cas9 en células car t: un método refinado para la preparación de bibliotecas

Improving CRISPR-Cas9 Screens in CAR T Cells: A Refined Method for Library Preparation

Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have demonstrated remarkable efficacy in several hematological malignancies, yet their success has not ...

improving-crispr-cas9-screens-car-t-cells-refined-method-for-library

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El video describe un proceso para crear células CAR-T modificadas genéticamente a través del sistema CRISPR-Cas9. La infección de las células T con lentivirus CRISPR y CAR da lugar a modificaciones en el gen diana y a la síntesis de un receptor de antígeno quimérico o CAR, lo que en última instancia conduce a la formación de células CAR-T modificadas genéticamente.

Modificación genética de células CAR-T mediante un sistema CRISPR-Cas9

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

Aquí, presentamos un protocolo para optimizar CRISPR Cas9 para lograr una mayor especificidad sin la pérdida de actividad en el blanco. Utilizamos un enfoque de evolución dirigida llamado Sniper-pantalla para encontrar a un mutante Cas9 con las características deseadas. Sniper-Cas9 es compatible con truncado solo guía RNAs y entrega en un formato de ribonucleoproteína, conocidas estrategias para lograr mayor especificidad.

Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Este manuscrito describe un enfoque de cribado basado en células a escala del genoma para identificar interacciones extracelulares entre receptores y ligand.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.

Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

El artículo describe un protocolo para la aplicación de un modelo in vitro de agotamiento para completar un cribado de knockout de CRISPR en todo el genoma en células T receptoras de antígenos quiméricos de donantes sanos.

Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos

Aprende un protocolo optimizado de CRISPR-Cas9 en células CAR T humanas primarias. Este método mejora la recuperación de cassettes sgRNA mediante digestión enzimática y captura selectiva, facilitando la identificación de reguladores genéticos para potenciar terapias de inmunoterapia.

Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas

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