Ensayo de inmunofluorescencia multiplexado para la evaluación espacial de marcadores de senescencia in vivo

El análisis espacial de las células senescentes es importante para comprender su contribución a procesos como el envejecimiento, el cáncer, la inmunidad y la homeostasis de tejidos normales. La detección de células senescentes se basa en el perfilado de múltiples biomarcadores. La inmunofluorescencia multiplex permite el perfil de alto rendimiento de estos dentro de una sola sección de tejido.

Para empezar, verifica que las secciones de tejido fijadas en formalina, incrustadas en parafina o FFPE, de 5 micrómetros de espesor, con un tamaño máximo de 4 x 2 centímetros cuadrados, estén montadas centralmente sobre portaobjetos de microscopía cargadas positivamente y sean claramente visibles dentro de la ventana de visualización del portaobjetos sin cubierta. Realiza los pasos de preparación de la muestra, ya sea manualmente usando una cámara de desocultación o automáticamente mediante un teñidor automático. Coloca las láminas preparadas en el portadeslizantes sin cubierta.

Alinea los bordes superior y derecho contra los topes metálicos. Bloquea la corredera con ambas manos a la vez para girar las levas de plástico a la posición cerrada con candado. Verifica que el deslizador esté completamente plano y no se balancee dentro del portacarga.

Coloca el ClickWell, inserta la cámara sobre la corredera y aprieta las barras laterales con ambas manos para limitar la presión y evitar roturas. Carga el pozo de clic con 2 mililitros de medio de montaje que contiene un 50% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato a través del puerto de entrada. Añade una etiqueta de código de barras en el lado izquierdo de la lámina en cualquiera de las dos orientaciones y luego procede a la imagen.

Para la selección de regiones y el análisis de autofluorescencia, abre la versión 4204 de Mx Workflow, software de adquisición de imágenes multiplexadas. Haz clic en Herramientas para seleccionar Editor de protocolos. En la ventana emergente Multiplex Protocol Publisher, introduce el nombre del protocolo.

Haz clic en Crear Ronda de Configuración, seguido de añadir Siguiente Ronda de Protocolo para crear varias rondas de etiquetado de biomarcadores. Haz clic en Publicar y luego selecciona Aceptar en la ventana emergente. Adquiere el canal Cy3 para imágenes virtuales de H&E.

Haz clic en Slide y luego Crear un nuevo lote. Tras seleccionar el nombre del protocolo, introduce el ID de la diapositiva. Haz clic en Añadir diapositiva y luego selecciona Crear lote para crear un flujo de trabajo de experimento multiplex. Abre el software de adquisición Cell DIVE.

Haz clic en Cargar para cargar la lámina en el microscopio. En el menú desplegable de Herramientas, haz clic en el icono de la cuadrícula para definir las regiones deseadas y utiliza la herramienta Mover para reposicionar las regiones definidas. A continuación, utiliza la herramienta Dibujar para deseleccionar cualquier campo que no sea necesario, asegurándote de que cada campo de visión tenga al menos dos campos de visión vecinos para evitar problemas de costura, y haz clic en Guardar regiones.

En la ventana de flujo de trabajo MX, haz clic en Viewer QC para abrir la página del visor de Cell DIVE y visualizar la imagen del tejido con ampliación 10x. Haz clic en el icono de corrección de imagen para ajustar el brillo de la imagen y haz clic en Enviar control de calidad para seleccionar Pasar y Recargar Deslizamiento en la ventana emergente. Cuando la imagen se recargue, haz clic en Agregar ROI para dibujar y ajustar las regiones de interés.

Selecciona los campos de visión deseados y repite la suma de ROI. A continuación, haz clic en Enviar al laboratorio. Carga la diapositiva para iniciar la adquisición de imagen con autofluorescencia 20x.

En el menú de Control de calidad de imagen, seleccione la casilla correspondiente al ID específico de la diapositiva y luego haga clic en Comprobante de calidad del visor. Haz zoom en la imagen cargada para escanear regiones desenfocadas o artefactos. Revisa las imágenes de fondo de cada canal, que se restarán de la señal final del biomarcador. Haz clic en Enviar control de calidad, luego selecciona Pasar y Salir para generar imágenes de fondo.

Antes de la tinción secuencial de biomarcadores, centrifugar los anticuerpos a 13.000 G durante un minuto a temperatura ambiente para limitar los artefactos. Preparar la solución de anticuerpos a una dilución de 1 en 200 en solución salina tamponada con fosfato, o PBS, que contiene 0,3% de albúmina sérica bovina, o BSA. Quita el medio de montaje pipeteando desde el puerto ClickWell.

Y lava tres veces con 2 mililitros de PBS que contenga 0,01% Tween 20 o PBST durante 5 minutos. Añade 350 microlitros de solución de anticuerpos en el puerto para asegurar una cobertura completa de la muestra dentro de la cámara de tinción. Incuba durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, extrae la solución de anticuerpos por pipete desde el puerto ClickWell. Y lava tres veces con 2 mililitros de PBST durante 5 minutos. Añade 2 mililitros de soporte de montaje.

Introduce el soporte ClickWell en el microscopio y carga la lámina para iniciar la imagen de biomarcadores 20x. Realiza la QC de imagen usando el editor de mezcla y las opciones de corrección de imagen y envía la evaluación de QC de imagen. Extrae el soporte de montaje por el puerto ClickWell y lava tres veces con 2 mililitros de PBST durante 5 minutos.

Prepara la solución de inactivación del tinte de forma fresca antes de usarla. Después de retirar PBST, añade 2 mililitros de solución inactivadora de colorante para cada portaobjetos. Incuba durante 15 minutos en el portaportaobjetos.

Extrae la solución de inactivación del tinte del puerto ClickWell y lava con 2 mililitros de PBST durante 5 minutos. Añade 2 mililitros de medio de montaje e inserta el soporte ClickWell en el microscopio para iniciar una imagen autofluorescente automática específica de ronda 20x. Avanza en el flujo de trabajo pasando los pasos de control de calidad indicados en pantalla al finalizarlo.

Repite la tinción secuencial, la inactivación de colorantes y la imagen multiplexada para tantos marcadores como sea necesario, y continúa hasta finalizar. Utiliza el software HALO para seleccionar varios canales que visualizen la localización de marcadores en distintas regiones del núcleo tisular. Haz clic en Analizar y selecciona Imagen Completa para analizar las métricas cuantitativas de los marcadores individuales.

Haz clic en Resultados para ver el número total de células en el núcleo tisular analizado y el subconjunto de células que expresan marcadores específicos. En comparación con el método automatizado basado en teñidor de diapositivas, el método manual basado en cámara de desocultación resultó en una mayor frecuencia de artefactos tisulares caracterizados específicamente por desprendimiento de tejido así como por pérdida o desprendimiento de núcleos. La cuantificación realizada con software de patología digital en tejido pancreático representativo reveló que las células p16 positivas estaban asociadas con niveles más bajos de LB1 y viceversa, demostrando un perfil consistente con los patrones de marcadores asociados a la senescencia.

Un mapa de calor normalizado con puntuación Z ilustra la distribución del fenotipo de senescencia p16 positivo lamina-B1 negativo en varios tejidos, revelando altas concentraciones de células senescentes en el pulmón, glándulas suprarrenales y pituitarias, correspondientes a niveles elevados de p16 y disminución de LB1. Por el contrario, el apéndice, el ganglio linfático y el bazo mostraron baja senescencia, manteniendo alta expresión de LB1 y baja expresión de p16. Este protocolo permite sondear una combinación de biomarcadores de senescencia, estructurales e inmunitarios dentro de una sola lámina de microscopía.

Combinando múltiples marcadores dentro de una sola muestra, se puede realizar un análisis espacial de la arquitectura tisular y la distribución celular senescente. Las aplicaciones futuras incluyen el perfilado a gran escala de biomarcadores de senescencia a través de múltiples tipos de tejidos y la integración con ómicos espaciales para resolver mejor la heterogeneidad celular.