Aislamiento de pericitos de tejido cortical de ratón usando FACS para secuenciación unicelular

Nuestra investigación examina los parásitos cerebrales centrándose en sus roles vasculares y sus interacciones dentro de la unidad neurovascular para comprender la función cerebral. Baja imagen y el FACS espacial en un proceso intestinal mapeo o función parasitaria dentro de la vasculatura cerebral revelan los roles específicos de la ubicación y los objetivos terapéuticos. Para empezar, rocía la zona de la cabeza y el cuello de un ratón eutanasiado con etanol al 75%.

Con un bisturí, realiza una incisión en la línea media del cuero cabelludo desde la región occipital hasta la frontal para exponer el cráneo. Realizar una incisión transversal anterior a las órbitas bilaterales, seguida de incisiones laterales a lo largo de los márgenes inferiores del cerebelo para desprender la base del cráneo. Incisa el calvario longitudinalmente a lo largo de la sutura sagital de posterior a anterior.

Levanta el colgajo craneal junto con un duramatero para exponer el cerebro. Con tijeras quirúrgicas, eleva suavemente el cerebro mientras se seccionan los nervios ópticos y la conexión entre la médula oblonga y la médula espinal. Coloca el cerebro intacto con cuidado en un plato de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de PBS bien frío, evitando cualquier daño.

Transfiere el cerebro a papel de aluminio. Expone el espacio subaracnoideo. Después de quitar la duramadre con pinzas, enjuágala con la solución salina equilibrada de Hank.

Transfiere el papel de seda a papel de filtro y retira el piater enrollándolo. Con una cuchilla de afeitar corta y descarta el bulbo olfativo y las secciones más caudales, y secciona el cerebro coronalmente en rodajas de dos a tres milímetros de grosor. Aisla la corteza cerebral a lo largo del cuerpo calloso.

Transfiere el tejido cortical a ampollas que contienen tres mililitros de tampón de recogida de tejido helado. Utilizando bisturís quirúrgicos, tritura el tejido y las ampollas en fragmentos de aproximadamente uno por un milímetro, y completa el picado en cinco minutos para preservar la frescura del tejido. Preenjuaga las puntas de la pipeta con un amortiguador de recogida de tejido.

Luego aspira lentamente los fragmentos picados hacia el ápice de la punta mientras sostienes la pipeta en vertical. Expulsa suavemente los fragmentos en tubos de centrífuga de 15 mililitros prerefrigerados. Lava las ampollas originales con 2% FBS en suero salino PBS.

Transfiere el lavado a los mismos tubos de la centrífuga y centrifuga a 300G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Desecha el sobrenadante tras centrifugarlo. Resuspende cada pellet en tres mililitros de solución de trabajo enzimática CD.

Alicuota la suspensión por igual en tres tubos y añade una solución enzimática adicional para alcanzar un volumen final de cinco mililitros por tubo. Incubar los tubos en un horno de hibridación a 37 grados Celsius durante 100 minutos con agitación orbital a 100G. Durante la incubación, añadir un mililitro de dnase a una solución a 10 mililitros de 2% FBS en PBS.

Termina la digestión centrifugando a 300 G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Luego resuspende cada pellet en un mililitro de solución de disociación tisular. Pipetear la solución 100 veces para ayudar en la disociación mecánica.

A continuación, agrupa todas las suspensiones en un único tubo de centrífuga de 50 mililitros. Enjuaga cada tubo con dos mililitros de tampón y combina los lavados. Tras centrifugar a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descartar la capa superior, añade 12,5 mililitros de 20% de BSA y invierte para mezclar.

Centrifuga a 1000 G a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Ahora recoge el pellet inferior y transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo centrifugador de 50 mililitros. Resuspende suavemente antes de centrifugar de nuevo.

Resuspende cada pellet en dos mililitros de 2% FBS en PBS. Luego combina ambas suspensiones en un solo tubo. Centrifuga la suspensión combinada a 300G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Después de descartar el sobrenadante, vuelve a suspender el último pellet en dos mililitros de PBS con un 2% de FBS. Prepara cuatro tubos centrífugos de 15 mililitros que contienen cuatro mililitros de solución al 22% por llamada. Acoloca suavemente alicotas de 0,5 mililitros de la suspensión de la celda sobre cada pendiente y centrifuga a 560G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de aspirar el sobrenadante, resuspende cada pellet en un mililitro de buffer de glucosa HBSS BSA. Luego desmonta las suspensiones a un tubo nuevo de 15 mililitros. Enjuaga los tubos de percol con dos mililitros de tampón y combina los lavados antes de centrifugar a 300G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Para la citometría de flujo, resuspende el pellet en un mililitro de buffer de glucosa HBSS BSA tras aspirar el supernadante. Añade cinco microlitros de reactivo bloqueador del receptor FC e incuba a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Luego pipetear anticuerpos conjugados fluorescentes a la suspensión antes de incubar.

Lava las células con seis mililitros de tampón de glucosa HBSS BSA. Luego centrifuga la suspensión a 300 G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de aspirar el sobrenadante, vuelve a suspender el pellet en un mililitro de tampón.

Añade 200 microlitros de solución de siete aminoactinomicinas D e incuba sobre hielo durante 10 minutos. Luego ajusta el volumen final a dos mililitros con buffer HBSS suplementado con BSA y glucosa. Enjuaga la superficie interna de los tubos de recogida de clasificación con una solución al 1% BSA.

Aspira el exceso de solución, dejando exactamente un mililitro de solución en cada tubo. Guarda los tubos sobre hielo para recibir las células clasificadas. Las células disociadas del tejido cerebral fueron secuencialmente controladas por el área de dispersión hacia adelante y el área de dispersión lateral para excluir los restos celulares durante la clasificación por citometría de flujo.

Se excluyeron los eventos duales positivos CD45 y CD41 positivos para eliminar células hematopoyéticas y contaminantes plaquetarios. Las células de pared vascular CD13 positivas fueron enriquecidas. Y se excluyeron células apoptóticas utilizando siete amino actinomicina D negativa, seguida de selección CD31 negativa para aislar parásitos.

La clasificación por citometría de flujo mostró que las células nucleadas representaban el 59,8% de todos los eventos. Las células CD13 positivas representaron el 1% de todos los eventos. Y la población final de parásitos positivos CD13 positivo al CD31 representó el 0,7% de todos los eventos.

La reducción dimensional de la UMAP de las células clasificadas reveló seis grupos principales distintos que indican heterogeneidad celular dentro de la población aislada. El análisis de mapas de calor normalizados por Z-score demostró que los genes marcadores parásitos se expresaron de forma alta y predominante en los grupos cero a tres. El análisis de proporción de grupos mostró que los grupos cero a tres constituían el 87,1% de la población total.

Mientras que los marcadores de células musculares lisas se enriquecieron en el grupo cuatro con un 10,14% y los marcadores de fibroblastos en el grupo cinco con un 2,77%. Este protocolo permite a los investigadores aislar parásitos portátiles de alta pureza adecuados para secuenciación de células individuales posteriores y análisis funcional. El principal desafío es la ausencia de marcadores parasitarios altamente específicos, el aislamiento complicado y el aumento del riesgo de contaminación secular. Futuros estudios pueden centrarse en identificar marcadores específicos de parásitos, permitiendo una mejora del aislamiento, una caracterización funcional más profunda e investigaciones terapéuticas dirigidas.