Método estandarizado para detectar nanotubos de túnel en células de piel humana para aplicaciones de ingeniería tisular

Desarrollamos métodos para detectar y analizar de forma fiable los nanotubos de túnel entre células de la piel humana y estudiar su posible papel en la regeneración cutánea. Nuestro protocolo está diseñado para muestras fijas o para células primarias de la piel humana. Es útil en investigaciones relacionadas con la biología de la piel y la regeneración de tejidos.

Para empezar, descongela y cultiva queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos en recipientes de 60 milímetros que contienen el medio de crecimiento adecuado. Suplementar los cultivos de queratinocitos con Y-27632 hasta una concentración final de cinco micromolares durante la reanimación. Mantén todos los cultivos a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia.

Luego retira el medio del plato de cultivo. Enjuaga brevemente las células con un mililitro de PBS para mantener el pH fisiológico y la osmolaridad durante el lavado. Aspira completamente el PBS.

Añade un mililitro de EDTA al 0,05% de tripsina y distribúyelo uniformemente por la superficie celular. Incuba el plato a 37 grados Celsius durante 1,5 a 2,5 minutos. Resuspende suavemente las células pipeteando arriba y abajo.

Añade dos mililitros de medio de cultivo para neutralizar la tripsina. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo de 15 mililitros y centrifuga a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, descarta el sobrenadante del tubo de la centrifugadora.

Resuspende el pellet celular en uno a dos mililitros de medio y cuenta las células usando un contador automático. A continuación, sembra 12.000 fibroblastos dérmicos o 20.000 queratinocitos en cada pozo de una cámara de ocho pozos en un volumen final de 400 microlitros. Después de la siembra, agita bien la cámara en cruz para distribuir las células de forma uniforme e incuba las células a 37 grados Celsius durante aproximadamente 24 horas.

Tras la incubación, confirma si la confluencia celular es de alrededor del 80% bajo un microscopio. Cuando los cultivos alcancen el 80% de confluencia, añade suavemente varias gotas de solución fijadora, una directamente en el pozo de la cámara para prefijar las células. Incuba las células a temperatura ambiente durante cuatro minutos, asegurando que el fijador se distribuya de forma uniforme sin alterar las células.

Luego aspira el prefijador del pozo y añade 140 microlitros de solución fijadora fresca uno, asegurando una cobertura completa de la superficie del pozo. Incuba el portaobjetos a 37 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, retira el fijador del pozo de la cámara y añade 140 microlitros de cloruro de amonio de 100 milimolares para apagar los aldehídos residuales.

Incuba el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos. Enjuaga las muestras tres veces con PBS durante 30 segundos cada una a temperatura ambiente. Durante cada enjuague, pipetea suavemente el buffer a lo largo de la pared de la cámara para evitar lavar las células o dañar nanotubos de túnel.

Incubar las células con 140 microlitros de una dilución volumen-volumen 1:300 de aglutinina de germen de trigo Alexa Harina conjugada en PBS. Realizar la incubación en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos para marcar glicoproteínas de membrana plasmática y así visualizar nanotubos de túnel derivados de la membrana. Luego lava las células tres veces con PBS durante 30 segundos cada una.

Luego incuba las células con 140 microlitros de faloidina conjugado diluido de una a 250 veces en 1% BSA durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de lavar las células tres veces con PBS, incubarlas con 140 microlitros de solución DAPI durante cinco minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Finalmente, añade dos o tres gotas de medio de montaje a cada pozo e incuba la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Guarda las láminas a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante al menos 20 minutos hasta la obtención de la imagen. En cultivos dérmicos de fibroblastos, se observaron nanotubos de túnel como proyecciones largas y delgadas que conectan células adyacentes con membranas teñidas por aglutinina germinal de trigo y F-actina marcada por faloidina. En cultivos de queratinocitos epidérmicos, también se observaron nanotubos de túnel con protuberancias características F-actin positivas que conectan células vecinas.

En cocultivos de fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos, se detectaron consistentemente nanotubos de túnel entre fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos, visualizados mediante tinción de membrana y citoqueratina 5. Los nanotubos de túnel en las co-culturas mostraron una organización citoesquelética diversa, con ejemplos que contenían solo F-actina, tanto los filamentos, F-actina con alfa-tubulina parcial, como con niveles bajos de alfa-tubulina. El principal desafío es preservar el túnel en nanotubos.

Esto requiere una fijación suave, un tiempo adecuado y el uso de aditivos fijos recién preparados. Utilizando nuestro protocolo, los nanotubos tunelantes pueden medirse bajo diferentes condiciones celulares para explorar sus funciones potenciales. En el futuro, marcaremos mitocondrias con fluorescencia para estudiar su transferencia mediante nanotubos tunelados.