Secuenciación metagenómica de nueva generación del líquido cefalorraquídeo para la detección de patógenos del sistema nervioso central

Este es un protocolo basado en la investigación para la secuenciación metagenómica de nueva generación de muestras de líquido cefalorraquídeo, con el fin de permitir la detección de posibles patógenos dentro de la muestra. Los protocolos existentes de MNGS no tienen en cuenta el bajo rendimiento de ARN en el LCR. Este protocolo optimiza varios pasos para tener en cuenta la baja biomasa presente en estas muestras.

Para comenzar a descongelar las muestras de LCR sobre hielo, transfiere 100 microlitros a un mililitro de cada muestra a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego pipeteo cuidadosamente el sobrenadante, dejando atrás el pellet y 100 microlitros de sobrenadante. Añadir 100 microlitros de escudo de ARN de ADN a los 100 microlitros restantes del sobrenadante y la cápsula y mezclar bien.

Luego añade 600 microlitros de tampón de lisis de ARN de ADN y mezcla pipeteando hasta que la solución sea homogénea. Realizar el protocolo de extracción de ADN y ARN según las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones importantes. Realizar todos los pasos de centrifugación durante un minuto a máxima velocidad, excepto el lavado final de ARN de ADN, que debe centrifugarse durante tres minutos.

Para eluir la muestra, añade 22 microlitros de agua libre de nucleasas directamente sobre la matriz de columnas. Luego incuba durante tres minutos a temperatura ambiente. Tras la pipeta elluciana, el flujo vuelve a la matriz de columna, centrifuga de nuevo durante un minuto a máxima velocidad antes de transferir la muestra a un nuevo tubo de almacenamiento de 1,5 mililitros.

Pipetear los componentes necesarios para la fragmentación y cebado del ARN en un tubo PCR. Incuba el tubo en un termociclador con la tapa calentada ajustada a 105 grados Celsius. La pipeta mezcla el ARN fragmentado y cebado con ocho microlitros de agua libre de nucleasas y dos microlitros de mezcla enzimática de síntesis de primera cadena.

Incuba el tubo en un termociclador con la tapa calentada ajustada a 105 grados Celsius. Luego mezclo el ADN sintetizado por primera cadena con 48 microlitros de agua libre de nucleasa. Ocho microlitros de tampón de reacción de síntesis de segunda cadena y cuatro microlitros de mezcla enzimática de síntesis de segunda cadena.

Coloca el tubo en un termociclador y incuba durante una hora a 16 grados Celsius con la tapa calentada apagada. A continuación, realiza la purificación de perlas magnéticas usando una proporción de 1,8 veces de perlas magnéticas de inmovilización reversible en fase sólida. Eluir la muestra en 53 microlitros de agua libre de nucleasa.

Transfiere 50 microlitros del CDNA purificado de doble cadena que contiene el sobrenadante final a un tubo de PCR limpio y libre de nucleasa. En este punto, las muestras pueden congelarse a menos 20 grados Celsius durante la noche. Si la muestra se almacenó a menos 20 grados Celsius durante la noche, descongela sobre hielo antes de reiniciar.

Mezcla de pipetas 50 microlitros de CDNA doble cadena purificado con siete microlitros de tampón de reacción de preparación final y tres microlitros de mezcla enzimática de preparación final. Coloca las muestras en un termociclador e incuba a 20 grados Celsius durante 30 minutos y 65 grados Celsius durante 30 minutos con la tapa calentada apagada. A continuación, realiza el paso de ligación del adaptador sobre hielo creando primero una dilución de uno a 100 de adaptador en agua libre de nucleasa.

Pipetear la mezcla de la reacción de preparación final en un tubo que contenga 30 microlitros de mezcla maestra de ligadura, un microlitro de potenciador de ligadura y 2,5 microlitros del adaptador diluido. Coloca las muestras en un termociclador e incuba a 20 grados Celsius durante 15 minutos con la tapa calentada apagada. Después de eso, procede inmediatamente a la purificación de perlas magnéticas usando una proporción de 0,9 veces de perlas magnéticas de inmovilización reversible en fase sólida.

Luego elua en 17 microlitros de agua libre de nucleasa. Transfiere 15 microlitros del sobrenadante final a un tubo PCR limpio y libre de nucleasa. Ahora, el adaptador purificado por pipeta ligó CDNA en un tubo con tres microlitros de enzima del usuario, 25 microlitros de mezcla maestra Q 5 y 10 microlitros de cebadores únicos con código de barras.

Coloque el tubo en un termociclador con la tapa calentada ajustada a 105 grados Celsius e incube en las condiciones presentadas. Realizar una purificación final de perlas magnéticas usando una proporción de 0,8 veces de las perlas magnéticas. Luego eluye la muestra en 23 microlitros de agua libre de nucleasa.

Transfiere 20 microlitros del sobrenadante final a un tubo PCR limpio y libre de nucleasa. Cuantifique la concentración de las bibliotecas de muestras utilizando un kit de cuantificación de ADN y el fluorímetro correspondiente. Verifica que los controles de agua tengan concentraciones sustancialmente más bajas o no cuantificables en comparación con las otras muestras.

Evalúa el tamaño de la biblioteca de muestras pasando las muestras en una máquina automática de electroforesis capilar. Utiliza la plataforma web de código abierto Chan Zuckerberg ID para realizar análisis metagenómicos para la detección de patógenos. Inicia sesión en el ID de Chan Zuckerberg y haz clic en subir.

Selecciona metagenómica como tipo de análisis y elige los archivos FASTQ de entrada de la secuenciación. Introduce la información requerida de la muestra, incluyendo el nombre de la muestra, el tipo de muestra, el LCR y el ARN o ADN tipo nucleótido. Una vez finalizado el procesamiento, haz clic en la carpeta del proyecto que contiene las muestras y navega al panel de resumen.

Desplázate hacia abajo para examinar el número de lecturas por muestra. Revisa el porcentaje de lecturas que superan el filtro de control de calidad y la relación de compresión duplicada para evaluar si la PCR está sesgada sobre amplificación. Para determinar cualquier contaminación por ADN extraño dentro de la carpeta del proyecto, selecciona cada muestra de control de agua y haz clic en modelo de fondo para generar el modelo.

Durante el análisis, aplica el modelo y utiliza filtros umbral para establecer una puntuación NTZ superior a uno y eliminar contaminantes probables. Luego analiza los datos utilizando el software estadístico adecuado. Los datos de la electroforesis capilar y el electroferograma demostraron una biblioteca de muestras de ADND sobrefragmentada que contenía dímeros adaptadores no destinados a secuenciación.

La biblioteca CDNA, sin contaminación significativa por dímeros con adaptadores, estaba lista para agruparse y secuenciar. La secuenciación de próxima generación de metagenómica del LCR detectó patógenos diversos en las cohortes A y B, con al menos un patógeno en el 73,5% de las muestras de la cohorte A y el 51,2% de las muestras de la cohorte B. Un desafío clave es el pipeteo preciso debido a los bajos volúmenes junto con el secado sensible al tiempo, donde un secado insuficiente o excesivo puede comprometer los resultados.

Aunque este protocolo específico se centra en la detección de patógenos, los transcritos de ARN huésped generados por este protocolo pueden utilizarse para análisis posteriores adicionales. Por eso es importante que futuros estudios comparen el rendimiento de este protocolo particular de preparación y secuenciación de bibliotecas con métodos emergentes diseñados también para muestras dispersas, para ver cómo se compara, no solo en términos de detección de patógenos, sino también en análisis transcriptómicos.