Un modelo de lesión por hipoxia-reoxigenación en cardioides humanos autoensamblantes

Nuestra investigación se centra en encontrar nuevas formas de ayudar al corazón a regenerarse tras una lesión. Para ello, generamos organoides cardíacos autoensamblantes y realizamos estudios de hipoxia-reoxigenación. Este protocolo puede aplicarse para estudiar la respuesta a lesiones, intervenciones terapéuticas para promover la regeneración y puede emplearse para modelado específico de enfermedades por paciente.

Para empezar, aspira el medio de especificación del mesodermo cardíaco D1 y añade suficiente solución de desprendimiento celular para cubrir completamente las células cardíacas del mesodermo pluripotente inducidas por humanos. Luego coloca la placa en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Con una pipeta, añade un volumen igual de medios mesodermicos cardíacos D2 a cada pozo y pipetea suavemente arriba y abajo para liberar las células adheridas, transfiriendo la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.

Usando una centrífuga, pelleta las células a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Resuspende el pellet en un mililitro de medio de especificación de mesodermo cardíaco D2 que contenga cinco micromolares IWP-2 y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico en RB menos. Mezcla 10 microlitros de azul de tripán con 10 microlitros de la suspensión celular en un microtubo.

Contar las células utilizando el método preferido de conteo y luego diluir las células hasta una concentración de 100.000 células por mililitro en medios de especificación de mesodermo cardíaco D2 suplementados con dos micromolares tiazovivina. Transfiere la suspensión de la celda a un depósito de reactivo del tamaño adecuado. Luego, utilizando una pipeta multicanal, dispensa 100 microlitros en cada pozo de una placa de 96 pozos de unión ultra baja para lograr una concentración final de 10.000 células por pozo.

Gira la placa a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para inducir la formación de organoides cardíacos humanos en cultivo en suspensión. Observa la formación de una gran cápsula celular bien circunscrita en cada pozo. Si el pellet no está circunscrito, repite la centrifugación.

Después de 24 horas, prepare 10 mililitros de medio D3 que contengan cinco micromolares IWP-2 y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico en RB menos por placa. Usando una pipeta multicanal, añade 100 microlitros de medio D3 a cada pozo sin eliminar ningún medio existente. Al día siguiente, retira 100 microlitros de medio D3 de cada pozo.

Para minimizar el riesgo de aspiración, inclina la placa a un ángulo de 45 grados y sostiene una pipeta multicanal en un ángulo de 90 grados respecto a la pared lateral de la placa. Coloca la pipeta firmemente en la pared del pozo y aspira lentamente. Después de retirar el medio, reempláyelo por 100 microlitros de medio D4 que contengan cinco micromolares IWP-2 en RB menos.

Utilizando una pipeta de 1.000 microlitros con la punta cortada, transfiere los organoides cardíacos humanos a un tubo microcentrífuga de 1,7 mililitros. Deja que los organoides se hundan en el fondo del tubo y retira suavemente el exceso de medio. Añade solución salina con fosfato para lavar los organoides una vez.

Espera unos segundos a que se hundan y retira suavemente el exceso de PBS. A continuación, añade un 4% de paraformaldehído para fijar los organoides y coloca el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la fijación. Luego transfiere el número deseado de organoides fijos a un tubo microcentrífuga de 1,7 mililitros.

Retira la solución fijadora y lava los organoides con PBS que contiene 0,1% Tween 20. Prepara la solución primaria de anticuerpos diluyendo el anticuerpo hasta la concentración deseada en la solución de tinción. Con una pipeta, añade entre 50 y 100 microlitros de la solución primaria de anticuerpos a cada tubo de microcentrífuga, asegurando que los organoides estén completamente cubiertos.

Tras la incubación y los lavados posteriores, incubar la muestra con anticuerpo secundario diluido en solución de tinción durante 24 horas a cuatro grados Celsius sobre una plataforma agitadora. Tras la incubación, realiza lavados como se ha descrito anteriormente. A continuación, usando una punta de pipeta cortada, transfiere los organoides a una lámina de vidrio cargada positivamente.

Retira suavemente el exceso de PBS con Tween 20 y añade unas gotas de medio de montaje para cubrir los organoides. Coloca cuidadosamente una capa sobre los organoides para aplanarlos. Luego procede a realizar microscopía de fluorescencia.

Después de incubar los organoides fijos durante la noche en un 30% de sacarosa a cuatro grados Celsius, transfiere a un molde de plástico y añade una pequeña gota de compuesto a temperatura óptima de corte al molde, lo justo para cubrir los organoides. Con pinzas finas o una punta de pipeta, recoloca suavemente los organoides dentro del compuesto para que no se aglomeren y queden alejados de los bordes del molde. Coloca los organoides lo más cerca posible del fondo del molde para maximizar el número presente en una sola criosección.

Coloca el molde en un enfriador de poliestireno que contenga una capa de hielo seco para congelar la capa inicial de compuesto a temperatura óptima de corte. Espera unos minutos a que el compuesto se endurezca y luego mueve el molde a la encimera. Añade un compuesto adicional a temperatura óptima de corte hasta que el molde esté lleno.

Deja que la primera capa se derrita completamente antes de volver a poner el moho en el hielo seco para congelar completamente. Una vez congelados, almacenar los moldes a menos 80 grados Celsius o proceder a criosección para obtener secciones de seis micrómetros. Utilizando una pipeta, transfiere cinco mililitros de medios para la hipoxia por placa organoide cardíaca humana de 96 pozos a un matraz de cultivo celular.

Coloca el matraz dentro de una cámara para hipoxia y enjuaga la cámara con gas anóxico compuesto por 5% de dióxido de carbono y 95% de nitrógeno durante tres minutos. Coloque la cámara en una incubadora a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes de iniciar la hipoxia. Utilizando una pipeta multicanal, extrae aproximadamente 150 microlitros de medio de todos los pozos de la placa organoide cardíaca humana.

Luego, utilizando una pipeta de 200 microlitros, retira cuidadosamente el medio restante de cada pozo individual sin alterar los organoides. Añade 50 microlitros de medios para la hipoxia a cada pozo. Coloca la placa organoide cardíaca humana en la cámara de hipoxia.

Y enjuaga la cámara con gas anóxico compuesto por un 5% de dióxido de carbono y un 95% de nitrógeno durante tres minutos. Coloque la cámara de hipoxia en una incubadora a 37 grados Celsius durante seis horas. Para iniciar la reoxigenación, extrae los organoides cardíacos humanos de la cámara de hipoxia.

Utilizando una pipeta multicanal, añade 150 microlitros de RB+media precalentada a cada pozo. Finalmente, coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius y deje al menos tres horas de reoxigenación antes de realizar ensayos aguas abajo. Tras seis horas de hipoxia y 24 horas de reperfusión, la actividad extracelular de lactato deshidrogenasa aumentó significativamente en organoides cardíacos humanos lesionados en comparación con los controles no lesionados.

Los organoides cardíacos tratados con hipoxia mostraron núcleos de cardiomiocitos positivos para TUNEL, y el porcentaje de núcleos de cardiomiocitos positivos para TUNEL fue significativamente mayor en organoides lesionados en comparación con los controles no lesionados. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la formación de cicatrices con un aumento de la duración de la hipoxia antes de la reoxigenación. A las 24 horas tras la reperfusión, el 69% de los organoides cardíacos humanos no lesionados latían con forza, mientras que ninguno de los organoides lesionados latía.

Los organoides cardíacos humanos no lesionados mostraron transitorios sincronizados de calcio en cinco regiones de interés, con picos ocurriendo al mismo tiempo y con formas de onda similares. Los organoides cardíacos humanos lesionados no mostraron contracciones coordinadas y, en su lugar, mostraron transitorios espontáneos irregulares de calcio en las regiones de interés. Este protocolo permite a los investigadores imitar el infarto de miocardio en organoides cardíacos humanos derivados de iPSC.

El mayor desafío técnico para garantizar lesiones reproducibles es la eliminación completa de los medios existentes. Nuestros futuros estudios tienen como objetivo identificar factores que puedan promover la regeneración tisular en modelos organoides cardíacos humanos.