Desarrollo de nanovesículas envueltas en membrana de células madre mesenquimales para mejorar la entrega génica

En este protocolo, introducimos un método para preparar nanovesículas derivadas de células madre mesenquimales, que se asemejan a vesículas extracelulares y encapsulan los AAVs para mejorar la administración génica. A estas nanovesículas que contienen AAV se llaman CME-AAV. En comparación con el vector emergente de entrega génica EV-AAV, LOS CME-AAV ofrecen mayor flexibilidad en fuentes celulares y mayor rendimiento.

Para empezar, retira el medio de cultivo de un plato de cultivo que contiene células madre mesenquimales humanas con una confluencia del 70 al 90%. Utilizando un raspador de celdas, desconecta las células del plato de cultivo y transfiere a un tubo cónico que contiene PBS. Centrifuga las celdas recogidas a 300g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para pelletar las celdas.

Luego, lava el pellet celular dos veces con PBS y vuelve a centrifugar. Resuspende el último pellet celular en PBS suplementado con un cóctel inhibidor de proteasas. Luego, someter la suspensión celular a tres ciclos de congelación-deshielo para alterar la membrana plasmática y generar un lisado rudimentario.

Con una pipeta, homogeneiza bien el lisato. Luego, centrifugar a 1.000g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los restos celulares. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.

Centrifugar a 18.000g durante una hora a cuatro grados Celsius para pelletar la fracción de membrana. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet de membrana en PBS para obtener la fracción gruesa de membrana mesenquimatosa de células madre. Ahora, homogeneiza la suspensión de membrana pasándola secuencialmente por jeringuillas equipadas con agujas de calibre 20 a 27.

Determina la concentración de proteínas de la suspensión de membrana homogeneizada utilizando un ensayo de ácido bicinconínico. Alicueto la suspensión y guarda a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. Rehomogeneza la suspensión usando una jeringuilla calibre 27 después de cada ciclo de descongelación.

Mezcla la suspensión de membrana preparada con virus adeno-asociado, o AAVs, en una proporción de 150 microgramos de proteína por uno por 10 y la potencia de 10 copias genómicas. Incuba la mezcla a 37 grados Celsius durante 30 minutos con un suave agitado. Carga la membrana y la mezcla de virus en un mini extrusor equipado con una membrana de policarbonato de 400 nanómetros.

Pasa la mezcla por el extrusor 20 veces para favorecer la encapsulación. Sustituye la membrana de 400 nanómetros por una de 200 nanómetros y repite la extrusión. Recoge el virus encapsulado con suspensión de proceso, junto con virus no encapsulado y vesículas vacías.

Agrupa varios lotes, si es necesario, y procede inmediatamente a la purificación. Diluye la solución de iodixanol con 10x PBS y agua desionizada estéril para preparar soluciones al 40 y 25%. Usando una pipeta, añade un mililitro de iodixanol al 40% en la parte inferior de un tubo ultratransparente de pared fina abierta de 13,2 mililitros.

Luego, superpone tres mililitros de iodixanol al 25% sobre la capa del 40% para formar un gradiente discontinuo. Superpon suavemente siete mililitros de la suspensión procesada sobre la parte superior del gradiente. Equilibra los tubos y cárgalos en un rotor de ultracentrífuga con cubo oscilante.

Centrifugar a 150.000g durante tres horas a cuatro grados Celsius, usando aceleración rápida y desaceleración lenta. Luego, retira cuidadosamente los tubos sin alterar el gradiente. Recoge fracciones de un mililitro de arriba a abajo en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetados.

Mantén todas las fracciones en hielo. Ahora, identificar y agrupar las fracciones siete y ocho que contienen CME-AAV purificados en un nuevo tubo ultracentrífuga abierto. Compensa el volumen a 11 mililitros con PBS.

Luego, mezcla suavemente con una pipeta de un mililitro. Utilizando aceleración y desaceleración rápidas, centrifugar las fracciones acumuladas a 150.000g durante tres horas a cuatro grados Celsius. Descarta el sobrenadante con cuidado.

Resuspende el pellet en 50 a 200 microlitros de PBS estéril, dependiendo de la concentración deseada. Aliquot la preparación purificada. Luego, guarda a 80 grados Celsius hasta que se use más.

Preparar soluciones operativas de virus encapsulado y virus de control en PBS estéril. Añadir copias iguales del genoma del virus encapsulado o virus de control directamente al medio de cultivo en cada pozo. Incluir pozos de control negativos con un volumen equivalente de PBS o partículas virales vacías.

Haz girar suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme e incubar durante 24 a 72 horas, dependiendo del diseño experimental. Después, aspira suavemente el medio de cultivo. Lava las células dos veces con PBS sin desplazarlas.

Núcleos de tinte con Hoechst 33342 según las instrucciones del fabricante. Realizar imágenes de fluorescencia de células vivas utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con conjuntos de filtros adecuados para mejorar la proteína fluorescente verde y el Hoechst. Selecciona objetivos de 10x o 20x para cuantificación y objetivos de 63x para imágenes de alta resolución, si es necesario.

Adquiere al menos cinco campos de visión por pozo, usando parámetros de imagen idénticos. Guarda todas las imágenes en formatos raw y en escala de grises para análisis cuantitativo. La microscopía electrónica de transmisión reveló que las CME-AAV presentaban dimensiones de tamaño y estructuras de membrana similares a las vesículas extracelulares.

Los marcadores de membrana de células madre mesenquimales, CD73 y CD90, fueron detectados en CME-AAV mediante análisis de Western blot. Las tres principales proteínas cápsides virales asociadas a adeno-asociadas, VP1, VP2 y VP3, fueron identificadas en CME-AAV por SDS-PAGE. El análisis de NanoSight mostró que CME-AAV9.

El EGFP tenía un diámetro medio de 128,6 nanómetros y una concentración total de partículas de 1,32 por 10 a la potencia de 10 partículas por mililitro. La microscopía de fluorescencia demostró que CME-AAV9. La EGFP produjo un nivel notablemente mayor de expresión de proteínas fluorescentes verdes en células HEK293T.

El virus envuelto en membrana alcanzó una expresión génica aproximadamente 2,5 veces mayor, lo que sugiere una mayor absorción celular y una posible mejora del tráfico intracelular. La imagen bioluminiscente in vivo mostró que el hígado mostró la señal luminiscente más fuerte tras la administración de CME-AAV. El análisis cuantitativo de las regiones hepáticas reveló que la administración de CME-AAV resultó en niveles de expresión génica significativamente más altos.

Estos protocolos describen pasos para obtener AAVs purificados envuelto en membrana celular, o CME-AAV, mediante extrusión y ultracentrifugación por gradiente de densidad. Dos factores clave requieren una consideración cuidadosa: Preprocesamiento de fragmentos celulares para extrusión y optimización de la relación de mezcla fragmento de membrana a AAV para controlar la proporción partícula-AAV respecto al genoma. Estudios futuros pueden explorar aún más el recinto de membrana celular para mejorar la protección inmunitaria y las propiedades funcionales de la superficie, optimizando el CME-AAV como una plataforma versátil para la administración de AAV.