Establecimiento de cultivos primarios enriquecidos en zonas a partir de la corteza suprarrenal del ratón

Mi investigación investigó la regulación del microambiente suprarrenal, centrándose en la señalización de MCA y Wnt en la diferenciación de zonas glomerulosas y fasciculadas, así como en el desarrollo tumoral. Los métodos existentes no pueden distinguir claramente las zonas suprarrenales. Este protocolo enriquece ZG y ZF, permitiendo el estudio de diferentes tipos celulares.

Este protocolo puede aplicarse para estudiar la adrenofisiología en ZG y ZF, incluyendo la zonación y la diferenciación celular. Para aislar la glándula suprarrenal en un cultivo primario enriquecido en zonas, se utilizan entre 10 y 15 ratones machos adultos, de aproximadamente seis a siete semanas de edad. Después de eutanasiar al ratón, colócalo en una posición de decúbito dorsal sobre una superficie plana estéril y desinfecta el pelaje del animal con un 70% de alcohol.

Con tijeras, haz una incisión inicial en la región inguinal del abdomen. Extiende la incisión lateralmente hacia el tórax a ambos lados para exponer el peritoneo. Retrae la piel con cuidado.

Luego retrae suavemente los músculos abdominales para exponer la cavidad, evitando daños en los vasos sanguíneos y manteniendo una visualización clara de las glándulas suprarrenales. Cambia los instrumentos quirúrgicos para minimizar la contaminación microbiana. Identificar la glándula suprarrenal izquierda situada medialmente y superior al riñón izquierdo en el retroperitoneo, con forma ovalada y coloración rosa, rodeada de tejido adiposo blanco.

Utilizando pinzas romas, desplaza cuidadosamente los órganos adyacentes para mejorar la visualización de la glándula suprarrenal. Con tijeras, elimina la mayor parte del tejido adiposo circundante con cortes cortos y controlados para aislar la glándula suprarrenal. Evita agarrar directamente la glándula suprarrenal para evitar daños en su cápsula.

Colocar inmediatamente la glándula suprarrenal aislada en una bandeja de cultivo P60 que contenga 10 mililitros de medio DMEM F-12 precalentado hasta que se hayan recogido todas las muestras. A continuación, identifica la glándula suprarrenal derecha situada lateral y superior al riñón derecho en el retroperitoneo, señalando que su proximidad al hígado, el colon ascendente y los vasos sanguíneos cercanos puede dificultar la visualización. Manipula cuidadosamente las venas y arterias renales para evitar cortes accidentales y sangrados.

Después de aislar la glándula suprarrenal derecha, utilizando el mismo procedimiento que para la glándula suprarrenal izquierda, coloca ambas glándulas juntas en el mismo plato. Limpia el plato de cultivo con un 70% de alcohol antes de transferir las glándulas a la campana de flujo laminar. Luego, lava las glándulas suprarrenales tres veces transfiriéndolas secuencialmente por recipientes con PBS a 25 grados Celsius.

Tras el lavado final, recoge y mantén los tejidos separados en un cuarto recipiente que contenga DMEM precalentado para preservar la viabilidad durante la preparación de múltiples glándulas. Transfiere las glándulas suprarrenales a un papel filtro para la disección. A continuación, con pinzas finas, agarra la glándula suprarrenal por el tejido adiposo adherente.

Disecciona cuidadosamente la grasa sobre el papel de filtro con movimientos controlados para evitar dañar la cápsula. Asegúrate de que la glándula esté lisa e intacta, y libre de exceso de tejido adiposo y conectivo. Transfiere cuidadosamente las glándulas suprarrenales a un papel de filtro nuevo para facilitar una microdisección precisa.

Con pinzas finas, pellizca suavemente la cápsula de la glándula suprarrenal. Con una hoja de bisturí, haz una incisión radial en la glándula sin cortar completamente el tejido. Aplica una ligera presión mecánica para expulsar el contenido interno de la corteza hacia fuera a través de la incisión.

Expone el material glandular interno manteniendo la cápsula y la zona glomerulosa conectadas a la punta de las pinzas. Identificar el material glandular interno expulsado como la zona fasciculada y la médula. Inicia la digestión enzimática solo después de que todas las glándulas hayan sido procesadas, para asegurar la adecuada separación mecánica de las zonas externa e interna.

Tras la centrifugación, se vuelven a suspender las células recogidas en un medio de cultivo. Tras establecer el cultivo de células suprarrenales, realizar la caracterización molecular de las células cultivadas mediante análisis de expresión génica e inmunotinción. Se establecieron con éxito cultivos primarios de células suprarrenales a partir de la fracción externa enriquecida para células zonaglomerulosis y de la fracción interna enriquecida para células zonazonales fasciculadas.

El modelo ratón de trazado de linaje permitió la visualización de la expresión específica de mGFP en zona glomerulosa impulsada por el promotor Cyp11b2. La expresión de mGFP se observó predominantemente en cultivos enriquecidos con zonaglomerulosa, mientras que los cultivos enriquecidos en zonas fasciculadas expresaron principalmente mTomato. Se observaron niveles más altos de expresión relativa de Cyp11b2, Dab2 y Sonic hedgehog en cultivos de fracciones externas en comparación con los cultivos de fracciones internas.

Los cultivos de fracciones internas mostraron una mayor expresión relativa de Cyp11b1 y Akr1b7 en comparación con los cultivos de fracciones externas. La secreción de aldosterona fue mayor en los cultivos enriquecidos con zonaglomerulosa que en los enriquecidos con zonas fasciculadas. En cultivos de fracciones externas, la secreción de aldosterona aumentó aún más tras la estimulación con angiotensina II, potasio y hormona adrenocorticotrópica.

La secreción de corticosterona fue mayor en los cultivos enriquecidos con fasciculatas en zonas en comparación con los enriquecidos con glomerulosa. Los cultivos enriquecidos con zonas fasciculadas mostraron un aumento en la secreción de corticosterona en respuesta a la estimulación de hormonas adrenocorticotrópicas y forskolina. Este protocolo permite el estudio de la fisiología y diferenciación específicas de zonas, incluyendo la producción hormonal, la vía de señalización y la matriz extracelular.

Estudios futuros pueden explorar los mecanismos de zonación y diferenciación suprarrenal, y el uso de estas células para construir un modelo 3D y estudiar las interacciones con la ECM.