La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

La electroforesis en célula individual es una técnica especializada que permite la introducción de ADN u otras macromoléculas en células individuales dentro de un tejido intacto, incluso en preparaciones in vivo cuando se combina con técnicas avanzadas de imagen in vivo. La electroforesis en célula individual de marcadores fluorescentes permite la visualización directa de la morfología celular, el crecimiento celular y los eventos intercelulares en escalas temporales que van desde segundos hasta días. En este video, detallamos el procedimiento para realizar la electroforesis en célula individual de un colorante fluorescente o de ADN plasmídico en neuronas dentro del cerebro intacto de la rana Xenopus, y mostramos ejemplos de imágenes en vivo de neuronas marcadas con fluorescencia.

Oh, hola. Mi nombre es Eth Haa y trabajo en el laboratorio del Dr. Kurt Haass en el Centro de Investigación Cerebral de la Universidad de Columbia Británica. Hoy, demostraré cómo realizar la electroporación dirigida de una sola célula en neuronas dentro del cerebro intacto de la rana XUS Lavis albina.

La ventaja distintiva de esta técnica es que se pueden realizar manipulaciones experimentales en células individuales mientras se deja el tejido circundante sin alterar, permitiendo así distinguir los efectos autónomos celulares de aquellos derivados de tratamientos globales. El primer paso consiste en fabricar micropipetas con un diámetro de punta y un ángulo de conicidad adecuados, seguido de la carga del material de transferencia en la micropipeta. Luego, los grupos de TA deben ser anestesiados y transferidos a la cámara de registro, seguido de la inserción de la micropipeta en el cerebro y la aplicación de una serie de pulsos de voltaje.

Finalmente, las neuronas etiquetadas se visualizan mediante microscopía de dos fotones. Esta técnica se mostrará en renacuajos. La activación de células individuales también puede utilizarse en otros sistemas modelo, así como en preparaciones ex vivo.

Así que, teniendo esto en cuenta, comencemos. La electroforesis en una sola célula dirige su acción a una célula individual mediante el uso de una microelectrodo de vidrio estirado que restringe el campo eléctrico a una única célula en contacto con la punta de la pipeta. La geometría física de la punta de la pipeta es una característica fundamental que afecta directamente el éxito de la técnica.

Se utiliza un micropipeteador modelo P 97 para generar micropipetas a partir de vidrio de borosilicato con un diámetro externo de 1,5 milímetros y un diámetro interno de 0,75 milímetros que contiene un filamento interno para facilitar el llenado de la punta sin burbujas de aire. Las puntas de pipeta que se han demostrado más eficaces para la electroforesis en una sola célula son aquellas con un diámetro de punta de 0,5 a un micrón y ángulos de conicidad superiores a 10 grados. Después de estirar una micropipeta de vidrio, el material en solución se puede cargar en la pipeta mediante llenado por succión o utilizando una jeringa de carga.

Para esta demostración, etiquetaremos fluorescentemente neuronas individuales con un colorante fluorescente como el que se muestra aquí o con un plásmido que codifique. Las soluciones de la proteína verde fluorescente GFP deben centrifugarse brevemente a alta velocidad para reducir la cantidad de partículas de desecho que ingresan a la pipeta. Dado que esto aumenta la probabilidad de obstrucción de la punta para los usuarios novatos, se recomienda comenzar con colorantes fluorescentes, ya que pueden verse fácilmente mediante fluorescencia epiluminiscente.

Esto permite la visualización de la punta dentro de la muestra y proporciona una retroalimentación directa sobre si el equipo se ha configurado correctamente y si la punta de pipeta es adecuada. Buen trabajo. Ahora que hemos preparado la micropipeta, podemos continuar con el procedimiento para la electroporación de una sola célula.

El equipo eléctrico necesario para esta técnica incluye un estimulador, un osciloscopio y un porta-pipetas equipado con un alambre de plata que se insertará en la pipeta. Aquí estamos utilizando un Axon Instruments AxoSeparator 800 A, aunque también pueden usarse estimuladores comunes como el Grass SD9. El AxoSeparator está conectado al cabezal, que actúa como interfaz entre el AxoSeparator y el electrodo de alambre de plata.

El electrodo externo para la rana es simplemente un alambre plateado que mantiene un contacto electrónico con la rana. Durante la electroforesis, el cabezal, el cable de tierra y el electrodo externo para la rana están conectados ambos a la entrada del osciloscopio. Una vez que el equipo eléctrico ha sido configurado, la pipeta puede colocarse en el soporte de pipeta.

El porta-pipetas debe montarse en un micromanipulador de tres ejes que permita movimientos finos. La electroforesis de célula individual requiere un microscopio con una buena distancia de trabajo. Dado que esto proporciona más espacio para maniobrar y permite introducir la pipeta en un ángulo de aproximadamente 30 a 45 grados.

Una vez que el equipo ha sido conectado adecuadamente, podemos comenzar con un procedimiento de electroforesis en una sola célula. Primero, las larvas se anestesian por inmersión en MS 2,2,2 al 0,02 %, momento en el cual las larvas generalmente quedan completamente anestesiadas. Después de aproximadamente cinco minutos, se transfiere una sola larva a la cámara de electroforesis.

Utilizando una pipeta de transferencia de plástico, se puede fabricar fácilmente en el laboratorio una cámara mediante la realización de una cavidad con forma de renacuajo en un pequeño bloque de silicona e insertando un cable de plata a tierra de modo que esté en contacto con la piel del renacuajo cuando esté dentro de la cámara. A continuación, utilizando un pincel para posicionar al renacuajo, se asegurará que quede con el lado dorsal hacia arriba. Luego, se baja la micropipeta hasta que entre en contacto con la piel directamente adyacente a la región de interés.

La continuación de la bajada de la pipeta inicialmente provocará un hundimiento en la piel y luego penetrará en el tejido subyacente. Aquí estoy apuntando al túbulo óptico del cerebro del palo de marea. Específicamente, apunto a la región de la capa de cuerpos celulares.

Si está utilizando un xi, se puede monitorear la resistencia de la pipeta en el tejido. Por lo general, la resistencia está entre 10 y aproximadamente 40. Megaohmios funcionan bien.

La resistencia de la pipeta es un buen indicador de si el diámetro de la punta es demasiado pequeño o si la punta está obstruida, en cuyo caso la resistencia será alta. Por otro lado, si el diámetro de la punta es demasiado grande o si la punta está rota, la resistencia de la pipeta será baja. Aunque la resistencia absoluta, la pipeta no puede medirse cuando se utiliza un estimulador convencional.

La lectura del osciloscopio es una medida indirecta de la resistencia de la pipeta para los colorantes de dextrano fluorescente. El estímulo consiste en una serie de 10 milisegundos de pulsos cuadrados positivos aplicados a una frecuencia de 300 hercios. Cada pulso individual tiene una duración de 300 microsegundos y se aplica a un voltaje de 50 voltios.

Con estas configuraciones, el colorante fluorescente es expulsado desde la punta, como puede observarse tras la aplicación de un estímulo después de la electrosondización. En un sitio, se retrae la pipeta y el proceso se repite en diferentes sitios dentro del tejido para mejorar el rendimiento. Mientras se aplica un tren de pulsos de voltaje, se debe monitorear la amplitud de los pulsos resultantes en el osciloscopio y ajustar la amplitud entre uno y 1,5 microamperios si es necesario.

Si la amplitud del pulso permanece baja tras aumentar considerablemente el voltaje o disminuye durante el transcurso del procedimiento, esto sugiere fuertemente que la punta está obstruida o que su diámetro es demasiado pequeño. Esto puede ser bastante frustrante cuando ocurre. Por otro lado, si la amplitud sigue siendo alta tras reducir considerablemente el voltaje aplicado o aumenta durante el procedimiento, esto indica claramente que la punta es demasiado ancha, que está rota o que las puntas se rompen.

Suelo emocionarme y entristecerme mucho. Como se mencionó anteriormente, la ventaja de usar colorantes fluorescentes es que se puede verificar inmediatamente si las células individuales han sido electroporadas utilizando los parámetros de estímulo dados. Si las células aparecen muy tenues o no hay células marcadas, se comenzaría por aumentar gradualmente cada parámetro de estímulo independientemente hasta que las células marcadas parezcan estar intensamente fluorescentes como en este caso; ver células bien marcadas alegra mi día.

Por otro lado, si pareciera que numerosas células están marcadas, se disminuirían gradualmente los parámetros del estímulo hasta que pareciera que una sola célula está intensamente marcada como esta. Ver células intensamente marcadas es realmente satisfactorio. En el caso del ADN plasmídico, los trenes de impulsos utilizados son pulsos negativos de un milisegundo de duración entregados a 300 hercios, y la duración del tren es de 500 milisegundos.

Después de la electroforesis, los renacuajos TA se colocan en una solución de cría fresca donde se recuperan rápidamente de la anestesia. Típicamente, tras electrofectar de 50 a cien renacuajos TA, podemos proceder a su selección, lo cual les mostraré a continuación. Antes de comenzar los experimentos de obtención de imágenes, es útil tamizar rápidamente los renacuajos electrofectados utilizando un microscopio de fluorescencia epi derecho.

Con el fin de determinar qué renacuajos contienen neuronas adecuadas para el análisis por imagen, se anestesian los renacuajos y luego se colocan en una cámara de cigarro; a continuación, se cubren individualmente con una laminilla los cerebros de los renacuajos. Posteriormente, se observan rápidamente bajo luz epi-fluorescente para determinar si están presentes neuronas individualmente marcadas con fluorescencia. Téngase en cuenta que la exposición excesiva a la luz epi-fluorescente provocará fototoxicidad, lo que podría matar la célula marcada. Por lo tanto, trate de minimizar el tiempo que las células permanecen expuestas a la luz fluorescente.

En el caso de los colorantes de dextrano, el cribado puede realizarse tan pronto como 30 minutos después de la electrotransferencia. Sin embargo, observamos que intervalos más largos se asocian con niveles de fluorescencia de fondo más bajos. En el caso del plásmido, el cribado de ADN se realiza típicamente al menos 12 horas después de la electrotransferencia.

Usamos rutinariamente la electroforesis de célula individual para marcar con fluorescencia neuronas dentro del tectum óptico de la larva. Nuestro microscopio de dos fotones es de fabricación personalizada, construido a partir de un microscopio confocal Olympus FV 300 y una fuente de luz láser Chameleon XP. Normalmente utilizamos una longitud de onda de 910 nanómetros para imaginar la fuerza verde fluorescente.

Una vez que hemos encontrado una renacuaja con una sola neurona AL marcada y la hemos colocado en nuestro equipo de dos fotones, procedemos a realizar imágenes de fotones con lapse de tiempo en neuronas táctiles durante diferentes intervalos temporales. Esto nos permite observar los patrones dinámicos de crecimiento de las arborizaciones dendríticas de las células AL. Aquí vemos un ejemplo de una neurona que expresa GFP y que fue marcada mediante electroforesis en una sola célula.

Esta imagen fue capturada mediante microscopía de dos fotones in vivo con el fin de cuantificar el crecimiento neuronal. Típicamente se generan reconstrucciones tridimensionales esqueletizadas de cada imagen neuronal. El registro de imágenes con intervalos prolongados proporciona información sobre las consecuencias a largo plazo de una manipulación experimental.

Aquí observamos una neurona inmadura que expresa GFP y que ha sido capturada diariamente durante cuatro días, abarcando el desarrollo de su arborización dendrítica. Estas imágenes fueron obtenidas mediante microscopía de dos fotones y se presentan como proyecciones en Z. La adquisición rápida de imágenes en lapsos de tiempo nos permite observar la naturaleza de procesos más dinámicos del crecimiento neuronal, incluyendo la formación y retracción de filopodios dendríticos.

Este video muestra una neurona expresando GFP relativamente madura que fue capturada en tres dimensiones cada dos minutos durante una hora. Este es un ejemplo de una neurona expresando GFP inmadura que fue capturada cada cinco minutos a lo largo de una hora. Las neuronas más jóvenes son altamente dinámicas, mostrando un crecimiento extenso de ramas y retracción de ramas.

Una vista ampliada de esta neurona que expresa GFP muestra la adición y retracción constantes de filopodios dendríticos, característicos de las neuronas en desarrollo en este sistema. La transparencia del renacuajo albino y la accesibilidad de su cerebro hacen que este sistema modelo sea ideal para visualizar el crecimiento neuronal y los eventos intracelulares dentro de un organismo vivo. La electroforesis en una sola célula nos permite visualizar el crecimiento de una neurona individual y realizar manipulaciones autónomas a nivel celular dentro de un cerebro que por lo demás permanece sin alterar.

Así que acaban de mostrarles cómo realizar la electroforesis de célula individual en polos de tata lavis zap, aunque aquí nos centramos en la electroforesis en polos TA. Esta técnica se ha utilizado en otros organismos y también se ha aplicado en cortes del hipocampo y cultivos celulares disociados. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de modificar constantemente las puntas de sus micropipetas y los parámetros de estimulación para mantener un rendimiento elevado.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.