Un protocolo optimizado para la infección por Candida albicans en Schmidtea mediterranea para estudiar la patogénesis fúngica y la defensa del hospedador

Mi investigación se centra en las infecciones por Candida albicans y en cómo las respuestas del huésped influyen en la eliminación o en la progresión de la enfermedad. Un desafío clave es la falta de modelos para la infección fúngica temprana. Este protocolo utiliza planaria como una solución manejable y de alto rendimiento.

El sistema planario permite el estudio de la iniciación, progresión, eliminación y letalidad de la enfermedad, con una medición de alta resolución de las respuestas inmunitarias innatas. Para empezar, selecciona planarias Schmidtea mediterranea de aproximadamente cinco milímetros de longitud bajo un estereomicroscopio y asegúrate de que los animales estén completamente extendidos antes de medir. Evita usar planarias menores de cinco milímetros, ya que pueden incluir individuos con blastemas o desarrollo incompleto que produzcan resultados inconsistentes.

Además, excluye las planarias mayores de cinco milímetros, ya que los animales más grandes son menos adecuados para la inmunotinción por fluorescencia. Excluye animales con blastemas, tejido sin pigmentación o desarrollo incompleto de la pigmentación. Transfiere planarias sanas que cumplan todos los criterios de inclusión en dos mililitros de agua planaria fresca por pozo en una placa de poliestireno de seis pozos sin cultivo de tejidos.

Asignar pozos para controles negativos compuestos por animales no infectados o tratados simulados y controles positivos para animales infectados con Candida albicans silvestre. Retira toda el agua de cada pozo y sustituye por dos mililitros de agua planaria fresca para asegurar la uniformidad entre pozos. Permite que los animales se equilibren en el nuevo entorno durante un día antes de la infección.

Inclina la placa de seis pozos y retira suavemente toda el agua de un pozo a la vez, usando la técnica aséptica. Añade inmediatamente el volumen calculado de agua planaria y cultivo de Candida albicans al pozo antes de proceder al siguiente pozo. Anota la fecha y hora de la inoculación.

Coloca la placa de seis pozos inoculada en un lugar oscuro y estático a temperatura ambiente. Incuba la planaria con Candida albicans durante hasta 72 horas, dependiendo del punto final deseado. En el primer punto de tiempo, 24 horas después de la infección, inclina ligeramente la placa.

Luego, utilizando una pipeta de transferencia estéril, aspira el líquido que contiene cultivo de Candida albicans y despláchalo suavemente en una zona del pozo libre de animales para mezclar la capa fúngica asentada. Repite este paso entre cinco y diez veces por pozo para romper la capa fúngica asentada, evitando el contacto directo con las planarias. Observa el asentamiento fúngico sobre un fondo oscuro antes y después de los pasos de resuspensión para obtener la mejor visibilidad.

Resuspender pozos de control no infectados bajo condiciones idénticas. Repite este procedimiento a las 48 horas de la infección. A las 72 horas de la infección, transfiere las planarias a pozos frescos con dos mililitros de agua limpia, minimizando la retransmisión de hongos al usar un mínimo de líquido.

Una vez que los animales hayan sido transferidos, retira toda el agua y reemplázala por agua planaria fresca. Comienza a evaluar los resultados del huésped un día después de la infección y continúa diariamente hasta el punto final experimental deseado. Cuantifica el daño al huésped usando el sistema de puntuación estándar de cero a tres.

Tres días después de la infección, transfiera suavemente planarias a una nueva placa de seis pozos que contenga dos mililitros de agua planaria fresca por pozo, evitando la transferencia del cultivo fúngico residual. Observar animales usando microscopía óptica con un objetivo mínimo de 10 veces. Registra los resultados del anfitrión usando la hoja de puntuación estandarizada.

Además, se puede realizar inmunotinción anti-Candida para observar la colonización fúngica del epitelio del huésped durante la infección y la eliminación. La colonización epitelial fúngica se redujo notablemente cuatro días después de la infección, y a los siete días de la infección casi todos los hongos asociados a la superficie habían sido eliminados bajo condiciones ID50. Los controles no infectados permanecieron completamente asintomáticos.

Aproximadamente 7,0 por 10 a la potencia de siete células de Candida albicans por mililitro, aproximadamente el 30% eran asintomáticos, el 50% sintomáticos y el 20% estaban muertos. Aproximadamente 8,0 por 10 a la potencia de siete células de Candida albicans por mililitro, aproximadamente el 30% eran asintomáticos, el 20% sintomáticos y el 50% estaban muertos. La supervivencia mediana disminuyó de aproximadamente un 90% en 7,0 por 10 a la potencia de siete células de Candida albicans por mililitro a aproximadamente un 50% en 8,0 por 10 a la potencia de siete células por mililitro, y a menos del 25% en 8,5 por 10 a la potencia de siete células por mililitro.

La supervivencia global fue de aproximadamente el 50% en planarias infectadas con Candida albicans tipo salvaje, aproximadamente 8,0 por 10, a la potencia de siete células por mililitro, en comparación con el 100% de supervivencia en controles no infectados. Este protocolo permite el estudio in vivo de la dinámica huésped-patógeno integrando enfoques de imagen y moleculares en un huésped genéticamente manejable. Las aplicaciones futuras incluyen cribado mutante de alto rendimiento, estudios comparativos entre especies microbianas y adaptación para pruebas toxicológicas y de eficacia de fármacos.