Name: Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a aislar miofibras individuales intactas del músculo soleus murino mediante digestión optimizada con colagenasa. Este protocolo minimiza pérdida de fibras y contaminación, permitiendo inmunomarcación y expansión de células satélite con alta pureza.

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<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18%E2%80%9388+yr%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
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<li>Günther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
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<li>Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+single+myofibers+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus.</a> Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol tartrate</td><td>Meiji Yakuka Co., Ltd</td><td>711-12</td><td>Nombre del producto: Vetorphale inyección</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>US Biological</td><td>C3999</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>M9B2717</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-free DMEM</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569</td><td></td></tr><tr><td>High-glucose DMEM+GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Life technology</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Low-protein binding filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride</td><td>Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd</td><td>8816</td><td>Nombre del producto: Dorbene Inyección</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>4987211762100</td><td>Nombre del producto: Dormicum Inyección</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspension</td><td>Wako</td><td>161-23181</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S stain solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24-3875-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (25 mL)</td><td>IWAKI</td><td>2362-025</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>IWAKI</td><td>5 3/4 IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin dishes (100-mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020-100</td><td>Referenciado como placa de Petri en el manuscrito</td></tr><tr><td>Antibodies for immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-32723</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Myosin Heavy Chain</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB4470</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>AB-528428</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-MyoD</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-760</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Antibodies for immunoblotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated Anti-mouse IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA931</td><td>1:1000/ horseradish peroxidase</td></tr><tr><td>HRP-conjugated Anti-Rabbit IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA934</td><td>1:1000/ horseradish peroxidase</td></tr><tr><td>Mouse Anti-MyHC I</td><td>Sigma</td><td>M8421</td><td>1:1000/ Myosin Heavy Chain I</td></tr><tr><td>Mouse Anti-MyHC II</td><td>Sigma</td><td>M4276</td><td>1:1000/ Myosin Heavy Chain II</td></tr><tr><td>Mouse Anti-PGC-1&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-517380</td><td>1:1000/ Pparg coactivator 1 alpha</td></tr><tr><td>Mouse Anti-&alpha;-tubulin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3873</td><td>1:1000/ Alpha tubulin</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-COXIV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#4850</td><td>1:1000/ Cytochrome c oxidase IV</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2218</td><td>1:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GLUT4</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2213</td><td>1:1000/ Glucose Transporter 4</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-&beta;-actin</td><td>Proteintech</td><td>20536-1-AP</td><td>1:2000/ Nonmuscle Beta-actin</td></tr></tbody></table>

ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Single Fiber Isolation Assay for the Assessment of Oxidative Myofiber Behavior

Nuestra técnica demuestra que las fibras aisladas del sóleo (SOL) y del extensor largo del dedo (EDL) pueden ser inmunomarcadas eficazmente contra Pax7 (Figura 3B). Estas fibras aisladas pueden mantenerse en un medio de cultivo flotante (compuesto por DMEM + GlutaMAX con suero de caballo al 10%, 1% AB, 0,5% CEE) durante 3 días, seguidos de inmunomarcaje (Figura 3B). No se recomienda mantener las fibras flotantes más de 4 días. Bajo las condiciones descritas de fibra flotante, las miofibras tienden a agregarse después de este tiempo, comprometiendo el análisis posterior de inmunomarcaje.
La técnica presentada puede utilizarse además para la inmunoblot en todo el programa miogénico (Figura 3C). De hecho, los mioblastos derivados de SOL y EDL se agruparon en placas de 24 pozos con una confluencia aproximada del 70%. Las células se mantuvieron en medio de crecimiento durante 1 día (mioblastos) o se indujo a diferenciarse durante dos o cuatro días (miotubos de formación temprana y miotubos diferenciados, respectivamente). Se cargaron cinco μg de proteína para el análisis de inmunoabsorbente.
La expresión de MyHC I se expresó casi específicamente en fibras musculares derivadas de SOL, con una expresión mínima en miotubos y despreciable en mioblastos (Figura 3C). MyHC II se expresó tanto en fibras musculares SOL como EDL. Esta expresión refleja el SOL, compuesto principalmente por los tipos I e IIa, mientras que el EDL está compuesto principalmente por fibras IIx e IIb. Los mioblastos no expresaron MyHC II, pero su expresión aumentó progresivamente durante la diferenciación. Las proteínas relacionadas con la oxidación PGC-1α y COXIV demostraron la mayor expresión esperada en fibras derivadas de SOL. Además, se detectó una mayor expresión de GLUT4 en fibras aisladas de SOL en comparación con fibras EDL. Un problema al que pueden enfrentarse los biólogos de músculos esqueléticos es que las proteínas de mantenimiento y controles de carga ampliamente utilizados, como la α-tubulina, la β-actina, GAPDH y las tinciones de proteínas totales incluyendo Ponceau S, no permanecen estables en mioblastos, miotubos y fibras musculares aisladas, cada una mostrando una variabilidad distinta. La intensidad de señal de α-tubulina y β-actina fue mayor en miotubos, mientras que la tinción con S de Ponceau fue relativamente débil en mioblastos. En contraste, el GAPDH mostró una mayor expresión en las fibras musculares de la EDL. No obstante, dependiendo del propósito experimental, una de estas proteínas de mantenimiento puede seguir siendo aplicable; alternativamente, se pueden explorar factores de normalización como la proteína de choque térmico 70 (HSP70).
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig1.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Disección del músculo sóleo. (A) Equipo necesario para la disección. 1: microtijeras, 2: pinzas finas, 3: tijeras diseccionadoras y 4: pinos de disección. (B) El tendón PLA fue cortado de los haces de tendones GAS y SOL (flecha amarilla). El tendón distal de PLA (flecha blanca) fue levantado con pinzas. (C) Se insertó un pasador de disección en el espacio entre el tendón proximal del SOL (flecha roja) y el GAS (flecha verde). (D) El SOL se separó del GAS mediante un pasador de disección. (E) Los haces de tendones GAS y SOL se cortaron en el lado de GAS. (F) Luego se cortó el tendón proximal SOL con microtijeras. (G) Se retiraron haces tendinosos distales adicionales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Aislamiento de fibras sóleo. (A) Equipo necesario para aislamiento. 1: de calibre estrecho y 2: pipetas Pasteur de ánima ancha. (B) Estereomicroscopio usado para aislamiento. (C) El sóleo digerido por colagenasa se transfirió al DMEM con un 1% de AB. (D) Las fibras del sóleo se disociaron del músculo tras las primeras 10 sesiones de enjuague. (E) Fibras individuales transferidas al segundo plato. (F) Imagen que muestra fibras limpias retiradas de restos y fibras reducidas. (G) Fibras simples libres de restos transferidas al tercer plato. (H) Fibras simples intactas claramente visibles. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Expansión del cultivo celular y análisis de muestras derivadas de EDL y SOL. (R) Tras 6 días tras el aislamiento, las muestras cultivadas con medio de proliferación muestran un cultivo de mióblastos puros obtenidos de fibras de sóleo aisladas. Barra de escala = 100 μm. (B) SOL y fibras individuales derivadas de EDL, inmediatamente o 3 días después del aislamiento, muestran células satélite inmunomarcadas para Pax7 (verde). La ausencia de MyoD (rojo) confirma que las células satélite aún no se han comprometido a activarse miogénicas. Las fibras se contrateñieron con DAPI (azul). Posteriormente, las células fueron observadas mediante un microscopio de fluorescencia. Barra de báscula = 20 μm. (C) Se utilizó 5 μg de proteína para la inmunoabsorción de mioblastos, miotubos y muestras derivadas de miofibras. Los paneles de inmunoblot muestran la expresión de MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubulina, β-actina y GAPDH se utilizaron como objetivos de mantenimiento y normalización. Se utilizó la tinción Ponceau S como control total de la carga de proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Skeletal muscle is composed of multinucleated myofibers whose integrity and function are essential for movement and overall health. In neuromuscular ...

single-fiber-isolation-assay-for-assessment-oxidative-myofiber

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Este video muestra el aislamiento de miofibras individuales del músculo extensor largo de los dedos murino (EDL) recolectado. Las miofibras aisladas se pueden cultivar para estudiar la actividad de las células madre musculares asociadas a las miofibras.

Aislamiento de miofibras: una técnica para obtener miofibras individuales a partir de músculo extensor largo de los dedos (EDL) de ratón

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.

Ensayo único de cultivo de Myofiber para la evaluación de la funcionalidad de las células madre musculares adultas ex vivo

La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.

Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Aprenda a aislar miofibras individuales intactas del músculo soleus murino mediante digestión optimizada con colagenasa. Este protocolo minimiza pérdida de fibras y contaminación, permitiendo inmunomarcación y expansión de células satélite con alta pureza.

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

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