Name: Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprende a cultivar células madre embrionarias humanas en estado pluripotente usando fibroblastos embrionarios de ratón y condiciones sin alimentador en matrigel. Esta guía práctica es esencial para investigadores en medicina regenerativa.

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Estudios en humanos con células madre embrionarias en el laboratorio Teitell el apoyo de un Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), las semillas de subvención RS1-00313. Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de amplias e Investigación de Células Madre de la UCLA, en especial el Dr. Amander Clark, el doctor Jerome Zack, y los miembros del Fondo para el UCLA amplio núcleo de célula madre Instituto por el apoyo de nuestros estudios.

Dividir las células madre embrionarias humanas (hESCs) chapada en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) Por lo general, una placa de células madre confluentes se puede dividir 01:06-1:10, dependiendo de la línea de células madre en particular. La placa de división, confluyen de nuevo 5-7 días después de partir. <ol><li> Dos días antes de partir, gelatinizar las placas con una solución de gelatina al 0,1%. Para una placa de 6 pocillos, agregar 2 ml en cada pocillo de la placa y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejido durante la noche. </li><li> Placa MEFs en gelatinizado placas de 6 pocillos el día antes de planificar sobre la división del hESCs. (NOTA: MEFs se puede platear hasta 3 días antes, si es necesario después de ~ 3 días, MEFs se vuelven más planos y más dispersa y no se puede sostener hESCs así como más fresco MEFs puede..) Tome un frasco de g-irradiados o mitomicina C tratados CF1 MEFs, que contiene 6.5 x 10 6 células, a partir de nitrógeno líquido y descongelación durante 2 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Lave las células una vez con los medios de comunicación cálida MEF Cultura en un tubo de 50 ml de halcón y resuspender en el volumen final de calentar el medio de MEF Cultura. En 5.6 x 10 6 células, esto es suficiente para la placa de dos o tres placas de 6 pocillos. </li><li> Mientras que el MEFs se están lavando, sacar las placas gelatinizada, eliminar toda la solución de los pozos y añadir 2,5 ml de medios de cultivo MEF por pozo. </li><li> Añadir 0,5 ml de suspensión por el MEF, así como para lograr 3 ml un volumen final en cada pocillo. Asegúrese de que MEFs son distribuidas uniformemente y coloque los platos de nuevo en la noche a la mañana para resolver la incubadora. </li><li> El día de la división de células madre, preparar dulce o uso &lt;2 semanas de edad estéril solución de colagenasa IV a 1mg/ml. Quite todos los medios de comunicación de los pozos de células madre que desea dividir, lavar una vez con 2 ml por pocillo de agua tibia 1 × PBS, pH 7,4, y añadir 1 ml de solución de colagenasa IV. Se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos. Tome la placa de células madre 6-y fuera de la incubadora y añadir 1 ml de ES medios de comunicación (sin bFGF) a cada pocillo. Usando la solución en cada pozo, con una pipeta de 1 ml aspirar los medios de comunicación y de golpe las células madre fuera de la placa. Para cada bien esta será de unos 5 a 10 repeticiones. Entonces, la transferencia de la hESCs suspendido en un tubo de 50 ml de halcón. Hacer esto para todos los pozos que se divide y se combinan en un tubo Falcon de 50ml. Se precipitan los hESCs a temperatura ambiente a 200 g por 5 min y lavar una vez con los medios de comunicación carecen ES bFGF. </li><li> Mientras que el hESCs se están lavando, sacar las placas MEF, quite todos los medios de comunicación de los pocillos y lavar una vez con agua estéril, tibia 1 × PBS, pH 7,4, a continuación, añadir 2,5 ml de ES medios de comunicación (ahora complementado con 10 ng / ml bFGF) por así. </li><li> Resuspender el hESCs granulado en un volumen adecuado de los medios de ES, complementado con 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Cuando el hESCs se resuspenden, deben ser de tamaño de las colonias más o menos uniforme y la forma, el volumen de resuspensión depende de la relación de división) con cuidado la pipeta la suspensión células madre hacia arriba y abajo varias veces para que las colonias más pequeñas y más uniformes, pero no tanto que las células individuales o colonias muy pequeñas se generan. Añadir 0,5 ml de suspensión de células madre por así a las placas MEF para lograr 3 ml en un volumen final en cada pocillo. Compruebe visualmente para asegurarse de que la hESCs se distribuyen uniformemente antes de colocar las placas de nuevo en la incubadora durante la noche a un acuerdo. Después de la siembra, por lo general se toman unos días de colonias a tomar su forma característica y apariencia de los bordes. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF). En el último paso antes de chapado, cuando la hESCs se resuspenden, deben ser de tamaño de las colonias más o menos uniforme y forma. Pipeta cuidadosamente la suspensión de células madre hacia arriba y abajo varias veces para que las colonias más pequeñas y más uniforme, pero no tanto que las células individuales o colonias muy pequeñas manchas generated.Immunofluorescence y citometría de fluj...

<table><tbody><tr><td>Sustituto de suero para knockout (KSR)</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Aminoácidos no esenciales</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reactivo</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Reactivo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina </td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reactivo</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Oct-4</td><td>Reactivo</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 conjugado con fito&amp;#8211;eritrina, ratón IgG3</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG de conejo conjugado con FITC</td><td>Reactivo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

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From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

Este video demuestra cómo cultivar células madre embrionarias humanas (hESC) sobre células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF).

Debido a su potencial significativo en medicina regenerativa, se está prestando cada vez más atención a la biología y manipulación de las células madre embrionarias humanas. En este video, le mostramos cómo cultivar y mantener células madre embrionarias humanas en un estado pluripotente utilizando células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón y condiciones libres de células alimentadoras sobre matrigel. Hola, soy Jinjiang de un laboratorio de micro título en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de California en Los Ángeles.Hoy les mostraremos un procedimiento para cultivar células madre embrionarias humanas sobre fibroblastos embrionarios de ratón, células alimentadoras derivadas de sangre y en condiciones libres de alimentadoras sobre gel de matriz. Este procedimiento incluye la preparación de fibroblastos embrionarios de ratón, la generación de medio condicionado con metilo para el crecimiento sobre gel de matriz, la preparación de placas de Magel y masas para el mantenimiento y crecimiento de células madre embrionarias humanas a lo largo del tiempo. Así que comencemos.Para comenzar el procedimiento de cultivo, se siembran células

from-mefs-to-matrigel-i-passaging-hescs-in-the-presence-of-mefs

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Investigación

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Biología

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

Diferenciación dirigida de células embrionarias humanas en específico ha generado mucho interés en la medicina regenerativa. Ofrecemos una concisa, paso a paso el protocolo para determinar...

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

La calidad de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) está dictada por la cepa derecha de ratón tal como CF-1. Pluripotencia-MEFs de apoyo y medios de comunicación condicionado (CM) obtenido a partir de éstas debe contener concentraciones óptimas de activina A, Gremlin y Tgfβ1 necesarios para la Activina / Nodal y las vías de FGF de manera cooperativa mantener la auto-renovación y pluripotencialidad.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.

La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Aprende a cultivar células madre embrionarias humanas en estado pluripotente usando fibroblastos embrionarios de ratón y condiciones sin alimentador en matrigel. Esta guía práctica es esencial para investigadores en medicina regenerativa.

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

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