Name: Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprende a analizar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en células madre embrionarias humanas mediante ensayos de actividad en gel. Este método permite evaluar la función mitocondrial con alta resolución.

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Estudios en humanos con células madre embrionarias en el laboratorio Teitell son compatibles actualmente con un Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), las semillas de subvención RS1-00313. Agradecemos a la Dra. Carla Koehler (UCLA) y los miembros del laboratorio de Koehler para proporcionar asesoramiento y conocimientos en estos y otros estudios.

Alta resolución clara Electroforesis en gel nativo (hrCNE) para el Complejo mitocondrial en gel ensayos de actividad Células madre embrionarias humanas (hESCs) se mantuvieron en una monocapa de fibroblastos de ratón irradiados ˠ o mitomicina C tratados con embrionarias (MEFs), luego pasó a un crecimiento en Matrigel durante 5 días en el MEF-medio condicionado con las condiciones estándar. Para eliminar la contaminación MEFs, hESCs fueron re-chapada en Matrigel y cultivadas en MEF medio condicionado por otros 3 días. Microscopio de inmunofluorescencia para los marcadores de pluripotencia Oct-4 y SSEA 4 se utilizó para confirmar la falta de diferenciación de células madre. <ol><li> Lavar las células con PBS caliente 1x, pH 7,4, seguido de tripsinización (1 ml de tripsina 1x por pocillo en una placa de 6 pocillos) durante 5 min. </li><li> Añadir un volumen igual de fresca inhibidor de tripsina (1mg/ml en 1x PBS, pH 7,4). Las células de la cosecha y se centrifuga a 200 g, 5 min, a temperatura ambiente. </li><li> Deseche las células pellets sobrenadante y resuspender en 0,8 - 1.7ml (basado en el tamaño de la celda de pellets) de hielo frío aislamiento de amortiguación mitocondrias (83 mm de sacarosa; 6.6mm imidazol / HCl, pH 7,0) con un recién preparada &quot;cóctel inhibidor de la proteasa. Incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Dounce células con un homogeneizador (~ 40 - 50 golpes). Tinción de una parte alícuota de las células dounced con azul tripán para comprobar la integridad de la homogeneización utilizando un microscopio de luz. </li><li> Centrifugar a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C para obtener un crudo pellet mitocondrial que también contiene núcleos y fragmentos más grandes de la célula. Se decanta y se desecha el sobrenadante y pesar el precipitado crudo mitocondrial de pellets. Los gránulos pueden ser almacenadas a -80 ° C tras la congelación instantánea en nitrógeno líquido, si esto es un punto de parada. NOTA: centrifugación diferencial o de otros procedimientos basados ​​en gradiente puede ser utilizado para el aislamiento y la recolección de una fracción pura membrana mitocondrial. Ver ref. 4 para más detalles. Este enfoque alternativo producirá la actividad mitocondrial complejo por mg de proteína mitocondrial en lugar de compleja actividad por mg de peso celular o el número de células. La concentración de proteínas mitocondriales tendrá que ser determinada después de la purificación para hacer esta comparación. Además, un aislamiento de amortiguación diferentes pueden ser necesarios para este enfoque. Para la solubilización de la fracción de membrana mitocondrial puro, vea la nota siguiente paso 6. </li><li> Solubilizar el crudo pellet mitocondrial en el hielo por agitación con tampón de solubilización de hielo frío (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM de 6 aminohexanoico). Ácido 6-aminohexanoico puede ser sustituido por el cóctel inhibidor de la proteasa 1x. Use 35μl de tampón de solubilización por 20 mg de peso de pellets. Añadir 20μl de 10% w / v digitonina por 20 mg de peso pellet y mezclar agitando el tubo. Incubar durante 50-10 min en hielo. Dodecil-bD-maltoside o Triton X-100 puede ser sustituido por digitonina para solubilizar las proteínas. La elección del detergente y su cantidad puede afectar la formación de supercomplexes o formas multiméricas de los complejos mitocondriales. Para más información, consulte ref.1. NOTA: La cantidad de detergente para solubilizar una fracción pura membrana mitocondrial corresponde a una relación en peso de detergente / proteína que van desde 2-6 g / g. La relación óptima para solubilizar las membranas mitocondriales es 2,5 g / g de dodecil-bD-maltoside, 3 g / g de Triton X-100, y 6 g / g de digitonina. </li><li> Centrifugar el sedimento solubilizada a 100.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante claro. </li><li> Añadir tampón de carga a una definitiva del 5% w / v de glicerol y 0,01% w / v Ponceau S (utilice un 50% w / v de glicerol, 0,1% w / v buffer Ponceau S carga solución madre). </li><li> Pozos de carga de gel con un volumen que contiene 20-40mg del crudo pellet mitocondrial por carril. Use un gel con gradiente de acrilamida (4 -13%) con un 3,5% gel de apilamiento. Nota: La preparación del gel y las condiciones de electroforesis: Para la preparación de gel, use un acrilamida / bis-acrilamida (AA / bisAA) 3 mezcla de la siguiente manera: 48 gramos de acrilamida y 1,5 g de bisacrilamida (49,5% T, 3% C. Donde T es la concentración total de AA y bisAA y C es el porcentaje de entrecruzamiento (bisAA) a monómero total). Gel buffer (3 &#39;): 1,5 millones 6 aminohexanoico; 75mm imidazol, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> En gel de gradiente: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Gel de apilamiento: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / 3 bisAA mezcla </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel de amortiguación 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> 10% de APS </td><td> 139 l </td><td> 125 l </td><td></td><td> 67 l </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 l </td><td> 12,5 l </td><td></td><td> 6,7 l </td></tr></tbody></table> Ánodo de buffer: 25 mM imidazol / HCl, pH 7,0 Tampón catódico: Tricina 50 mM, 7,5 mm de imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecil-bD-maltoside, 0.05% w / v desoxicolato, pH 7,0 Vierta y ejecutar los geles en un cuarto frío (4-7 ° C). La tensión inicial utilizada es de 100V. Cuando la muestra ha entrado en el gel de apilamiento, la tensión se eleva a 500 V con la corriente limitada a 15 mA (de 0.15 &#39;14&#39; 14 cm de gel). La electroforesis es detenido después de 3-4 horas cuando la línea divisoria de colorante rojo punzó el S se acerca a la parte delantera de gel. Por otra parte, un gel puede ser ejecutado durante la noche con una tensión constante en el 70-100V. <ol><li> En gel de ensayos de actividad. El tiempo de incubación para cada ensayo depende de la eficiencia de solubilización de proteínas y la cantidad de material cargado por pozo. Complejos I, IV y V por lo general el rendimiento señales más fuertes que los complejos II y III. </li></ol> Complejo I (CI) Incubar la rebanada de gel con CI de amortiguación (5 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) a temperatura ambiente durante varias horas. IC del búfer: Añadir por cada 100 ml de 5 mM Tris-HCl, pH 7,4: 0,01 g NADH 0,25 g de NBT Fijar el gel en el 50% de metanol y ácido acético 10% para 15-45 min. El gel se mantiene fija en 10% de ácido acético. El complejo II (CII) Incubar la rebanada de gel con la CII buffer (20 mM succinato de sodio; methasulfate fenazina 0.2mm; 2.5mg/ml NBT, 5 mM Tris-HCl pH 7,4) a temperatura ambiente durante varias horas. CII búfer: Añadir por cada 100 ml de 5 mM Tris-HCl, pH 7,4: 200μl succinato sódico 1M 80μl methasulfate fenazina (PMS 250 mm disuelto en DMSO) 0,25 g de NBT Fijar el gel como se describe para el Complejo I El complejo III (CIII) Incubar la rebanada de gel con CIII buffer (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 0,05% de 3,3 &#39;-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)) a temperatura ambiente durante varias horas. CIII búfer: Añadir por cada 100 ml de 50 mM de sodio-fosfato, pH 7,2: 50mg tetrahidrocloruro diaminobenzidina Fijar el gel como se describe para el Complejo I Complejo IV (CIV) Incubar la rebanada de gel con CIV buffer (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 0,05% de 3,3 &#39;-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB), 50 micras caballo corazón citocromo c) a temperatura ambiente durante varias horas. CIV búfer: Añadir por cada 100 ml de 50 mM de sodio-fosfato, pH 7,2: 50mg tetrahidrocloruro diaminobenzidina 0,1 g de caballos corazón del citocromo c Fijar el gel como se describe para el Complejo I Complejo V (CV) Incubar la rebanada de gel con tampón CV (35 mm Tris-base, 270 mm glicina, pH 8,3 a 25 ° C, 14 mm de MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8 mm ATP) a temperatura ambiente durante varias horas. CV búfer: 100 ml por la solución de añadir: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-base </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glicina </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> No hay necesidad de ajustar el pH (debe ser 8.3) - no utilizar ácido o base. Filtrar y añadir <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Fijar el gel en el 50% de metanol durante 30 minutos y la transferencia de agua.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

En este vídeo, que hemos descrito la extracción de complejos de proteínas mitocondriales de células madre embrionarias humanas, la separación de alta resolución clara electroforesis en gel nativo (hrCNE), y el posterior análisis en gel de ensayos de actividad catalítica. hrCNE resuelve complejos proteína de la membrana mitocondrial con una resolución comparable a la de la electroforesis en gel nativo azul y es superior para los ensayos de actividad en gel. Esta técnica se puede emplear no sólo para cuantificar respiratoria mitocondrial IV c...

<table><tbody><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>ajustar el pH a 8,0 con NaOH</td></tr><tr><td>NaCl 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sodio 1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 y BP329-1</td><td>Mezcle 68,4 ml de Na2HPO4 1 M y 31,6 ml de NaH2PO4 1 M para preparar un tampón de fosfato de sodio 0,1 M con pH 7,2 a 25 °C</td></tr><tr><td>Tricina 1 M, pH 7,0 (ajustado con NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>almacenar a 4 °C</td></tr><tr><td>Imidazol/HCl 1 M, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>almacenar a 4 °C</td></tr><tr><td>Tris-HCl 1 M, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil-β-D-maltósido (DDM) al 20 % (p/v)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Disuelto en agua. Almacene alícuotas de 1 ml a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Digitonina al 10 % (p/v) (&amp;gt;50 % de pureza, utilizada sin recristalización)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Disuelto en agua. Almacene alícuotas de 0,1&amp;#8211;1 ml a &amp;#8211;20 °C. Debe calentarse hasta 95 °C antes de usarlo.</td></tr><tr><td>Ácido 6-aminohexanoico 2 M</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>almacenar a 4 °C</td></tr><tr><td>Solución stock de Ponceau S/glicerol 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 y G6279-1L</td><td>Ponceau S al 0,1 %, glicerol al 50 % (p/v) en agua.</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio al 10 % p/v</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Disuelto en agua. Debe protegerse de la luz. Ajuste el pH a 7,0 con HCl, filtre y almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fenazina metasulfato (PMS) 250 mM</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Disuelto en DMSO y fraccionado. Almacene a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Nitroazul de tetrazolio (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobencidina tetrahidrocloruro (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de adenosina 5&amp;rsquo;-trifosfato (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grado I, mínimo 99 %</td></tr><tr><td>β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) forma reducida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c de corazón de caballo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasas 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Almacenar a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripano al 0,4 %</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 10x (0,5 %)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Las mitocondrias son orgánulos citoplásmicos que tienen un papel primordial en el metabolismo celular y la homeostasis, la regulación de la red de señalización celular y muerte celular programada. Las mitocondrias producen ATP, regulan el estado redox citoplasmático y Ca2 + equilibrio, catabolizar ácidos grasos, síntesis del grupo hemo, nucleótidos, hormonas esteroides, aminoácidos, y ayudar a armar hierro-azufre en las proteínas. Las mitocondrias también tienen un papel esencial en la producción de calor. Las mutaciones del genoma mitocondrial causar varios tipos de trastornos humanos. La acumulación de mutaciones en el ADNmt se correlaciona con la edad y se sospecha que tienen un papel importante en el desarrollo del cáncer. Debido a su papel de vital importancia en todos los tipos de células, la función de las mitocondrias también se debe ser crítico para las células madre. Principales avances se han hecho en nuestra comprensión de la viabilidad de las células madre, proliferación y capacidad de diferenciación. Sin embargo, la actividad funcional de las células madre, en su condición particular de la energía, no se ha estudiado en detalle. Casi nada se sabe acerca de las propiedades de las mitocondrias de células madre embrionarias humanas (hESCs) y su progenie diferenciada precursor. Una manera de entender y evaluar el papel de la mitocondria en células madre y la función potencial de desarrollo es medir directamente la actividad de los complejos respiratorios mitocondriales. A continuación, describimos alta resolución clara electroforesis en gel nativo y la posterior visualización en gel de la actividad como un método para el análisis de los cinco complejos de la cadena respiratoria de hESCs.

En este video, te mostramos cómo los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de las células madre embrionarias humanas pueden ser analizadas utilizando en ensayos de actividad gel.

Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Las mitocondrias son orgánulos citoplasmáticos que desempeñan un papel fundamental en el metabolismo y la homeostasis celular, la regulación de la red de señalización celular y...

Las mitocondrias tienen numerosas funciones en la fisiología celular, desde el metabolismo y la producción de energía hasta la muerte celular programada y la síntesis de hormonas esteroides. A pesar de la importancia de las mitocondrias tanto en funciones celulares fundamentales como en enfermedades, se conoce muy poco sobre la función de las mitocondrias en las células madre embrionarias humanas y sus descendientes diferenciados. En este video, le mostraremos cómo se pueden analizar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de células madre humanas mediante ensayos de actividad en gel.Hola, soy Ivan OV del laboratorio de Michael Tetel en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy les mostraremos un procedimiento para evaluar la función de los complejos respiratorios mitocondriales en células madre embrionarias humanas. Este ensayo de actividad en gel implica el aislamiento de un sobrenadante mitocondrial crudo a partir de células madre embrionarias humanas, la separación de los complejos mitocondriales del sistema de fosforilación oxidativa mediante electroforesis en gel nativo claro de poliacrilamida de alta resolución y, posteriormente, el análisis de actividad en gel.Así que comencemos. El primer paso en este procedimiento es aislar mitocondrias de células madre embrionarias humanas. Para este ensayo, utilizaremos células madre embrionarias humanas que se han cultivado en una placa recubierta con matrigel en condiciones libres de células alimentadoras.Para recolectar mitocondrias a partir de nuestras células madre humanas, comenzamos lavándolas con PDS 1X tibio a pH 7,4 y luego tratamos las células con tripsina durante cinco minutos. Puede utilizarse un mililitro de tripsina 1X por pocillo en una placa de seis pocillos. Después de cinco minutos, se puede detener la reacción añadiendo un volumen igual de inhibidor fresco de tripsina (un miligramo por mililitro) en PBS 1X y recolectar las células.Las células recolectadas se centrifugan luego a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células del sedimento en 0,8 a 1,7 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias frío con hielo, que contenga una mezcla recién preparada de inhibidor de proteasas al 1 x. La cantidad de tampón que utilice depende del tamaño del sedimento celular obtenido. Una vez que el sedimento haya sido resuspendido, incúbelo en hielo durante aproximadamente 10 minutos.Después de la incubación, rompemos las células con un homogenizador, lo que podría tomar aproximadamente de 40 a 50 movimientos. Podemos verificar la completa homogenización teñiendo una alícuota de las células DOD con azul de trian y observándolas mediante un microscopio óptico. Debería verse algo así.Este es el primer disparo tras 50 golpes con un downs. Este es el segundo disparo tras 80 golpes con un downs. Una vez que las células estén homogenizadas, centrifúgelas a 20.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados C. Esto nos dará un precipitado mitocondrial crudo, que también contendrá núcleos y fragmentos celulares más grandes.Antes de recolectar el pellet, debemos pesar el tubo de recolección para estimar el peso subsiguiente del pellet, verter y descartar el sobrenadante, y luego pesar el pellet crudo de mitocondrias precipitado. Restando el peso del tubo en este punto, se puede proceder a solubilizar el pellet, lo cual se mostrará en el siguiente paso. Para solubilizar el pellet mitocondrial crudo, comenzamos manteniendo el pellet en hielo y aplicando vortex con 35 microlitros de tampón de solubilización frío con hielo.Por cada 20 miligramos de peleto, contamos con información detallada sobre los compuestos del tampón, que se menciona en el protocolo escrito adjunto. Tras la agitación con vórtex y la adición del tampón de solubilización, y antes de añadir digitonina, transferimos el peleto resuspendido a un tubo adecuado para centrifugación a alta velocidad, y luego añadimos 20 microlitros de digitonina al 10% peso por volumen por cada 20 miligramos de peso de peleto, y mezclamos agitando ligeramente el tubo. Después de mezclar completamente, incubamos el peleto mitocondrial durante cinco a 10 minutos en hielo. Doil beta D multisido o DDM o Triton X-100 pueden sustituir a la digitonina para solubilizar las proteínas.La elección del detergente y su cantidad pueden afectar la formación de supercomplejos o formas multiméricas de los complejos mitocondriales tras la incubación en hielo. Y una vez que el precipitado haya sido solubilizado, lo centrifugaremos a cien mil veces G durante 15 minutos a cuatro grados C, y luego recogeremos el sobrenadante claro. Ahora estamos listos para preparar el sobrenadante y correrlo en nuestro gel en gradiente para la electroforesis nativa en gel con gradiente de mitocondrias.Recomendamos el uso de un gel de gradiente de acrilamida del cinco al 13 % con un gel de apilamiento del 3,5 %. Para preparar el gel, utilizaremos una mezcla de acrilamida-bisacrilamida según se describe en el protocolo escrito. La solución de acrilamida-bisacrilamida se prepara por adelantado y se almacena a cuatro grados Celsius en un lugar oscuro.El acrilamida y la bis-acrilamida son sustancias químicas tóxicas tanto en forma de polvo como en forma líquida, por lo que se debe prestar especial atención al manipularlas. Combinamos la solución de acrilamida-bis-acrilamida con una alícuota de tampón para gel tres veces, compuesto por 1,5 molar de ácido hexanóico seis amino y 75 milimolar de ole a pH 7,0. La cantidad de solución de acrilamida-bis-acrilamida que agregamos al tampón dependerá del porcentaje de gel que estemos preparando para hacer el gel en gradiente.Prepararemos una mezcla al 4 % y una mezcla al 13 %, y el gel de apilamiento será una mezcla al 3,5 %. No olvide añadir glicerol a la mezcla al 13 %. Cuando las tres mezclas estén listas, agregamos una cantidad adecuada de sulfato de amonio persulfato y TEMED a las mezclas y vertemos las mezclas en una cámara de moldeo formadora de gradientes.La parte izquierda de la cámara contiene la mezcla al 5%. La parte derecha de la cámara contiene la mezcla al 13% con una pequeña barra magnética de agitación. Comenzamos a verter el gel abriendo la parte derecha de la cámara.Luego, inmediatamente abrimos la parte izquierda de la cámara y dejamos que la solución al 5 % se mezcle con una solución al 13 % para formar el gradiente. Añadimos una pequeña cantidad de isopropanol sobre la parte superior del gel para formar un borde nítido y recto en el gel tras la polimerización. Aproximadamente una hora después, cuando se completa la polimerización del gel en gradiente, eliminamos el isopropanol y vertemos el gel de apilamiento al 3,5 % en el aparato e insertamos un peine para geles.Ensamblaremos y correremos los geles en una cámara fría de aproximadamente cuatro a siete grados Celsius. Para correr este gel, utilizaremos dos buffers diferentes. En la cámara del ánodo, usaremos un buffer que contenga ácido clorhídrico 25 milimolar pH 7,0.El tampón catódico contendrá 50 milimolar de tric, 7,5 milimolar de ácido ole clorhídrico, 0,02% peso por volumen de doil beta D multisido o DDM y 0,05% peso por volumen de deoxi coato pH 7,0. Con el fin de preparar el sobrenadante que se va a correr en el gel que acabamos de verter, se añade tampón de carga para obtener una concentración final de 5% peso por volumen de glicerol y 0,01% peso por volumen de Ponto S. Normalmente, añadimos una solución stock 10x que contiene glicerol y Poncho S directamente a los sobrenadantes.Ahora estamos listos para cargar la muestra en el gel. Cargaremos los pocillos del gel con un volumen que contenga entre 20 y 40 miligramos de proteína mitocondrial cruda por carril. Inmediatamente después de la carga, se realiza la electroforesis a 100 voltios.Una vez que la muestra ha entrado en el gel de apilamiento, el voltaje puede aumentarse a 500 voltios con la corriente limitada a 15 miliamperios. Aunque normalmente corremos el gel durante toda la noche a 70-100 voltios, detenemos la electroforesis cuando una línea nítida del colorante rojo de zos se acerca al frente del gel. Ahora que se ha corrido el gel, podemos analizar la actividad de los diferentes complejos proteicos directamente en el gel.El tiempo de incubación para cada ensayo depende de la eficiencia de solubilización de las proteínas y de la cantidad de material cargado por pocillo. Los complejos uno, cuatro y cinco suelen producir señales más intensas que los complejos dos y tres. Por esta razón, el tiempo de tinción para los complejos dos y tres debe ser más largo.Para probar la actividad del complejo, necesitaremos usar tampones específicos para cada complejo. Puede encontrar los ingredientes de los tampones individuales en el protocolo escrito. Ahora cortaremos las bandas individuales del gel para realizar los ensayos de actividad en gel por separado.Para todos los complejos, incubar el trozo de gel en sus respectivos tampones durante varias horas a temperatura ambiente, excepto para el complejo cinco. Después de la incubación, fijar el gel en metanol al 50 % y ácido acético al 10 % durante 15 a 45 minutos. El gel fijado se conserva en ácido acético al 10 %.Aquí puede observarse cómo aparece la tinción del complejo I. Hay una banda de color púrpura intenso en el trozo de gel que corresponde al complejo I. Los geles claros permiten realizar densitometría a partir de las actividades de los complejos mitocondriales y realizar análisis comparativos.Después de la citometría densa, generalmente secamos las rebanadas de gel para almacenamiento a largo plazo y/o para escanearlas con el fin de obtener una imagen de alta calidad. Dos complejos tiñen del mismo color púrpura: el complejo tres y el complejo cuatro. Ambos producen una banda teñida de color anaranjado o amarillento. A continuación se muestran ejemplos de las actividades de tinción de los complejos dos, tres y cuatro.Acabamos de mostrarle cómo analizar la actividad de los complejos de exudación mitocondrial, que se extrajeron de células madre embrionarias humanas y se separaron mediante electroforesis en geles nativos de alta resolución. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Aquí, describimos cómo estudiar la localización mitocondrial de una quinasa (ciclo celular) y cómo determinar su ubicación submitocondrial, así como los posibles sustratos/objetivos mitocondriales. La expresión forzada de proteínas en las mitocondrias proporciona una herramienta útil para estudiar las consecuencias funcionales de la localización mitocondrial de una proteína de interés.

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad...

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.

Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales

La preparación de muestras enriquecidas con mitocondrias a partir de tejidos sólidos archivados previamente congelados permitió a los investigadores realizar evaluaciones funcionales y analíticas de las mitocondrias en diversas modalidades experimentales. Este estudio demuestra cómo preparar preparaciones enriquecidas con mitocondrias a partir de tejido cardíaco congelado y realizar evaluaciones analíticas de las mitocondrias.

Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Aprende a analizar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en células madre embrionarias humanas mediante ensayos de actividad en gel. Este método permite evaluar la función mitocondrial con alta resolución.

Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

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