Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Mitocondrias Tienen numerosas funciones en la fisiología celular, desde el metabolismo y la producción de energía hasta la programación de la muerte celular y la síntesis de hormonas esteroides. A pesar de la importancia de las mitocondrias tanto en las funciones celulares fundamentales como en las enfermedades, se sabe muy poco sobre la función de las mitocondrias en las células madre embrionarias humanas y su progenie diferenciada. En este vídeo, le mostraremos cómo se pueden analizar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de las células madre de amry humano mediante ensayos de actividad de Ingel.

Hola, soy Ivan OV del laboratorio de Michael Tetel en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy te mostraremos un procedimiento para evaluar la función del complejo respiratorio mitocondrial en células madre embrionarias humanas. Este procedimiento implica el aislamiento del paladar mitocondrial crudo de las células madre embrionarias humanas, la separación de los complejos mitocondriales del sistema de fosforilación exudativa con electroforesis en gel de poliacrilamida nativa clara de mayor resolución y la posterior actividad en gel sa.

Así que comencemos. El primer paso en este procedimiento es aislar las mitocondrias de las células madre embrionarias humanas. Para este ensayo, utilizaremos células madre embrionarias humanas que se han cultivado en una placa cubierta de matrigel en una condición libre de alimento.

Con el fin de recolectar mitocondrias de nuestras células madre amry humanas, comenzamos lavándolas con uno caliente XPDS pH 7.4, y luego tripsina las células durante cinco minutos. Puede usar una milésima de pulgada de una x tripsina por pocillo en una placa de seis pocillos. Después de cinco minutos, puede detener la reacción agregando un volumen igual de inhibidor de tripsina fresco de un miligramo por mil en un XPBS y cosechar las células.

A continuación, las células recogidas se centrifugan a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar, deseche el sobrenadante y resus, suspenda las células peletizadas en 0,8 a 1,7 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias heladas con un cóctel recién preparado de un inhibidor de la proteasa. La cantidad de tampón que use dependerá del tamaño de la pastilla celular que obtenga Después de que la bolita se haya resuspendido, incube en hielo durante unos 10 minutos.

Después de la incubación, bajamos las células con un homogeneizador, esto puede tomar alrededor de 40 a 50 golpes. Podemos comprobar la lista completa de homogeneización tiñendo una alícuota de las células DOD con azul trian y mirando a través de un microscopio óptico. Debería tener un aspecto similar al siguiente.

Este es el primer tiro después de 50 golpes con un downs. Este es el segundo tiro después de 80 golpes con un downs. Una vez homogeneizadas las células, centrifugarlas a 20.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados C. Esto nos dará una pellet mitocondrial cruda, que también contendrá núcleos y fragmentos celulares más grandes.

Antes de la recolección del pellet, tenemos que pesar el tubo de recolección para estimar el peso del pellet posterior, verter y desechar el sobrenadante, y luego pesar el pellet mitocondrial crudo precipitado. Al restar el peso del tubo en este punto, se puede proceder a la solubilización del pellet, que se mostrará en el siguiente paso. Para solubilizar el pellet mitocondrial crudo, comenzamos manteniendo el pellet en hielo y vortexing con 35 microlitros de tampón de solubilización en frío hielo.

Por cada 20 miligramos de pellet que tenemos, la información detallada sobre los compuestos tampón se menciona en el protocolo escrito adjunto. Después del vórtice y la adición de tampón de solubilización y antes de agregar digit toin, transferimos el pellet resuspendido a un tubo apropiado para la centrifugación a alta velocidad, y luego agregamos 20 microlitros de 10% de peso por volumen digit toin para 20 miligramos de peso de pellet y mezclamos moviendo el tubo después de que se haya mezclado completamente para incubar el pellet mitocondrial durante cinco a 10 minutos en hielo. Doil beta D multiside o DDM o Triton X 100 pueden ser sustituidos por digit toin para proteínas solubilizadas.

La elección del detergente y su cantidad pueden afectar a la formación de supracomplejos o formas multiméricas de complejos mitocondriales tras la incubación en hielo. Y una vez solubilizado el pellet, lo centrifugaremos a cien mil veces G durante 15 minutos a cuatro grados C, luego recogeremos el sobrenadante claro. Ahora estamos listos para preparar el sobrenadante para que funcione en nuestro gel degradado para la electroforesis de mitocondrias con gel degradado nativo.

Recomendamos utilizar un gel degradado de acrilamida del cinco al 13% con un gel apilante del 3,5%. Para preparar el gel, utilizaremos una mezcla de acrilamida bis acrilamida como se describe en el protocolo escrito. La solución de acrilamida bis se prepara con anticipación y se almacena a cuatro grados centígrados en un lugar oscuro.

La acrilamida y la bis acrilamida son productos químicos tóxicos tanto en polvo como en forma líquida, por lo que se debe prestar especial atención cuando se trabaja con ellos. Combinamos la solución de acrilamida bis con una alícuota de tres x tampón de gel compuesto por 1,5 molar, seis aminoácidos de ácido hexa noico y 75 milimolares a pH 7,0. La cantidad de acrilamida bis solución de acrilamida que añadamos al tampón dependerá del porcentaje de gel que estemos haciendo para hacer el gel degradado.

Haremos una mezcla del 4% y otra del 13%, y el gel apilante será una mezcla del 3,5%. No olvide agregar glicerol a la mezcla al 13%. Cuando las tres mezclas están listas, añadimos una cantidad adecuada de amonio por sulfato y temid a las mezclas y vertemos las mezclas en una cámara de fundición de formación en gradiente.

La parte izquierda de la cámara contiene la mezcla del 5%. La parte derecha de la cámara contiene la mezcla al 13% en una pequeña barra de agitación magnética. Comenzamos a verter el gel abriendo la parte derecha de la cámara.

Luego, inmediatamente abrimos la parte izquierda de la cámara y dejamos que la solución al 5% se mezcle con una solución al 13% para hacer el degradado. Añadimos una pequeña cantidad de isopropanol a la parte superior del gel para formar un borde recto y afilado para el gel después de la polimerización. Aproximadamente una hora después, cuando se completa la polimerización del gel de gradiente, retiramos el isopropanol y vertemos el gel de apilamiento 3.5 en el aparato e insertamos un peine de gel.

Ensamblaremos y ejecutaremos los geles en una cámara frigorífica de unos cuatro a siete grados centígrados. Para ejecutar este gel, usaremos dos búferes diferentes. En la cámara del ánodo, utilizaremos un tampón que contiene 25 milimolares de ácido clorhídrico pH 7.0.

El tampón catódico contendrá 50 milímetros de ácido tric, 7,5 milimolares de ácido clorhídrico, 0,02% de peso por volumen, doil beta D multiside o DDM y 0,05% de peso a volumen, pH de desoxi coato 7,0. Con el fin de preparar el sobrenadante que se ejecutará en el gel que acabamos de verter, se añade un tampón de carga para producir una concentración final de 5% de peso a volumen de glicerol y 0,01% de peso a volumen. Ponto S, normalmente añadimos una solución madre de 10 x que contiene glicerol y poncho s directamente a los sobrenadantes.

Ahora estamos listos para cargar la muestra de gel en el gel. Cargaremos los pocillos de gel con un volumen que contenga de 20 a 40 miligramos de la proteína mitocondrial bruta por carril. Inmediatamente después de la carga, el gel funciona a 100 voltios.

Una vez que la muestra ha ingresado al gel de apilamiento, el voltaje se puede elevar a 500 voltios con la corriente limitada a 15 miliamperios. Aunque por lo general hacemos funcionar el gel durante la noche a 70 a 100 voltios, detenemos la electroforesis cuando una línea afilada del tinte rojo zos se acerca al frente del gel. Ahora que se ha ejecutado el gel, podemos analizar la actividad de diferentes complejos proteicos directamente en el gel.

El tiempo de incubación de cada ensayo depende de la eficiencia de la solubilización de las proteínas y de la cantidad de material cargado por pocillo. Los complejos uno, cuatro y cinco suelen producir señales más fuertes que los complejos dos y tres. Esta es la razón por la que el tiempo de tinción para los complejos dos y tres debe ser más largo.

Para probar la actividad compleja, necesitaremos usar búferes específicos para cada complejo. Puede encontrar los ingredientes para los tampones individuales en el protocolo escrito. Ahora cortaremos carriles individuales del gel para realizar los ensayos de actividad de Ingel por separado.

Para todos los complejos, incubar la rodaja de gel en sus respectivos tampones durante varias horas a temperatura ambiente para todos los complejos excepto para el complejo cinco. Después de la incubación, fije el gel en 50% de metanol y 10% de ácido acético durante 15 a 45 minutos. El gel fijo se conserva en ácido acético al 10%.

Aquí se ve cómo aparece la tinción de uno complejo. Hay una banda de color púrpura oscuro en la rebanada de gel que corresponde a una compleja. Los geles transparentes le permiten realizar densitometría a partir de actividades del complejo mitocondrial y realizar análisis comparativos.

Después de la citometría densa, generalmente secamos las rodajas de gel para el almacenamiento a largo plazo y/o para el escaneo con el fin de obtener una imagen compleja de alta calidad, dos tinciones del mismo color púrpura que una complejo tres y complejo cuatro. Ambos dan una banda de tinción de color naranja o amarillento. A continuación, se muestran ejemplos de actividades complejas de tinción dos, tres y cuatro.

Acabamos de mostrarte cómo analizar la actividad de los complejos exudativos mitocondriales, que se extrajeron de células madre embrionarias humanas y se separaron por una resolución más alta, incluyendo electros de gel nativo. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.