Name: La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprende a generar células iPS a partir de fibroblastos embrionarios de ratón mediante un sistema lentiviral inducible. Este protocolo detalla la reprogramación celular usando Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Paso 1: Descongelar 293 células y la placa para la producción de lentivirus. <ol><li> Prepare 9 ml de medio DMEM + en un tubo de 15 ml. </li><li> Eliminar un vial de 293 acciones congeladas desde el tanque de nitrógeno líquido y poner el frasco en un baño de agua a 37 ° C hasta su mayoría de las células (pero no todos) se descongelan. </li><li> Eliminar las células de la ampolla de congelación y el lugar en el tubo de 15 ml en el paso 1. </li><li> Centrifugar a 180 g por 5 min, y luego descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de medio DMEM +, y la transferencia de una gelatina con cubierta de 100 mm plato. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora hasta que el 80-90% confluente. </li><li> La aprobación de la 293 células: las células de lavado con PBS, aspirar el PBS y añadir 4 ml por cada 10 cm plato de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA y se incuba durante 1 min a 37 ° C. </li><li> Separar las células de los platos a la grabación, resuspender con 10 ml de DMEM + medio, y transferir a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 g por 5 min, y aspirar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen adecuado de DMEM + medio, y se rompen las células en una suspensión de células individuales pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Cuente el número de células y ajustar la concentración de 8x10 5 células por ml con medio FP. </li><li> Las células de las semillas a 8x10 6 células (10 ml) por placa de cultivo de 100 mm, y se incuba durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Paso 2: Transfectar 293 células con plásmidos lentivirus y virus de la cosecha <ol><li> Por cada placa de 10 cm, el uso de 10 mg FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), columna vertebral de lentivirus con 2.5ug del PMD-G y 7,5 g de pPax2. </li><li> Mientras que los tres plásmidos alícuotas en un tubo, entregar 30μl de reactivo de transfección Fugene 6 en un segundo tubo que contiene 500μl del DMEM sin suero y mezclar suavemente con el dedo tocando e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la mezcla de ADN gota a gota en el tubo Fugene 6/DMEM-containing, mezclar suavemente tocando los dedos y se incuba durante 20 min. </li><li> Añadir el ADN / Fugene 6 gota a gota complejo en el plato de 293, y se incuban durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> A la mañana siguiente: Aspirar el reactivo de transfección medio que contiene, añadir 5 ml de medio fresco de células ES, y volver a las células a la incubadora. </li><li> A las 48 horas y 72 horas después de la transfección, recoge el medio de la 293 mediante el uso de un niño de 10 ml jeringa desechable estéril, filtrándola a través de un filtro de poro de 0,45 micras de tamaño de acetato de celulosa, y la transferencia en un tubo de 15 ml. </li><li> Concentrar el sobrenadante del virus por ultracentrifugación. Resuspender el precipitado virus en el volumen deseado y hacer amixture de partes iguales del soporte de Oct-3/4-, Sox2, Klf4 y c-Myc-lentivirus. </li><li> Al tiempo que el virus, o preparar Oct4-neo/rtTA MEFs Oct4-GFP/rtTA (paso &lt;3) y el 90% de confluencia en los platos de 10 cm (2x10 6 células por placa) </li><li> Aspirar el medio de cultivo y lavar con 10 ml de PBS. </li><li> Deseche PBS, añadir 1 ml por placa de 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA y se incuba a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Añadir 9 ml del medio de cultivo, suspender las células en una sola célula, y transferir a un tubo de 15 ml. </li><li> Cuente el número de células, y ajustar la concentración de 8x10 4 células por ml. Transferir 10 ml de suspensión celular (8x10 5 células) a un plato de 10 cm recubiertas con gelatina. Incubar el plato de la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Aspirar el medio de un plato de fibroblastos, y agregar 10 ml de medio que contiene el virus. Se incuban las células a partir de 4 h de la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Después de 24 aspirar el medio de un plato de fibroblastos, y agregar 10 ml de medio fresco de células ES. </li><li> Vuelva a colocar medio normal de células ES con un medio que contiene doxiciclina para iniciar la expresión de los cuatro genes, es decir, iniciar la reprogramación. </li><li> Si se utiliza un reportero Oct4-neo, a continuación, iniciar la sección de drogas en cualquier momento entre 6 y 9 días. </li><li> Cambiar el medio de todos los días hasta que las colonias se lo suficientemente grande como para ser recogidos. Primeras colonias que se hacen visibles aproximadamente una semana después del inicio de la reprogramación. Deben ser lo suficientemente grande como para ser recogidos alrededor del día 20. </li></ol> Paso 3: Recogiendo las colonias iPS El día antes de contestar: <ol><li> Semilla de la cantidad necesaria de gelatina con cubierta 24 y placas con γ-irradiados DR4 MEFs </li></ol> Recogiendo clones en el Día 1: <ol><li> Alimentar a las colonias en las placas de 1-2 horas antes de la cosecha. </li><li> Añadir 15 l de PBS en los pocillos de una placa de fondo en V de 96 pozos. </li><li> Lave el recipiente que contenga las colonias para ser recogidos una vez con PBS y añadir 10 ml de PBS para el plato. </li><li> Elige las colonias con las puntas de pipeta pequeña 5μl (establecer el Pipetman P20, el 4 de l). La transferencia de colonies a un pozo en el plato de 96 pozos. </li><li> Añadir 20 l de tripsina a cada pocillo utilizando el multi-canal (12) pipetor. Pipeta de arriba a abajo 3 veces. Se incuba a 37 ° C durante 4 minutos. </li><li> Añadir 100 ml de medio de ES a las colonias con tripsina. Pipeta de arriba y abajo 10 veces. La transferencia de 6 clones en un momento en el plato de 96 pozos a un plato de 24 pozos con una punta en cualquier otra posición en el pipetor lugar 12. </li><li> Crecer las células en la placa de 24 pocillos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora hasta que las células llegar a 80-90% de confluencia, la alimentación diaria con el medio de células ES. Las células probablemente estará lista para expandirse en 3-7 días. </li></ol> Paso 4 <ol><li> Expansión de las células iPS <ol><li> Aspirar el medio, y se lavan las células con 1 ml de PBS. </li><li> Eliminar por completo PBS, añadir 0,1 ml de tripsina 0,25% / 1 mM EDTA y se incuba a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Añadir 0,4 ml del medio de ES y suspender las células pipeteando arriba y abajo a la suspensión de células individuales. </li><li> La transferencia de la suspensión celular a un pocillo de placa de 6 pocillos, agregar 1,5 ml de medio de células ES, y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora hasta que las células alcanzan el 80-90% de confluencia en placas de 6 pocillos. En este punto, preparar acciones congeladas de las células, de la siguiente manera. </li></ol></li><li> Preparación de las acciones congelar <ol><li> Aspirar el medio, y se lavan las células con 2 ml de PBS. </li><li> Eliminar por completo PBS, se añaden 0,5 ml de tripsina 0,25% / 1 mM EDTA y se incuba a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Añadir 2 ml del medio de ES y suspender las células pipeteando arriba y abajo a la suspensión de células individuales. </li><li> La transferencia de la suspensión de células a un tubo de 15 ml, cuente el número de células y centrifugar las células. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender las células con medio ES a la concentración en 2x10 6 células por ml. </li><li> Prepare dos células ES medio de congelación (20% DMSO en medio ES) y la alícuota es de 0,5 ml por vial. </li><li> La transferencia de 0,5 ml de la suspensión celular para congelar los viales y mezcle suavemente. </li><li> Ponga los viales en un contenedor de congelación de células y mantener a -80 ° C durante la noche, la transferencia a nitrógeno líquido al día siguiente para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

En este video, que muestra cómo utilizar un inducible, un sistema para generar lentiviral GFP-positivo, las células iPS pluripotentes a partir de MEFs derivados de ratones Oct4-GFP/R26-M2rtTA y Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Este procedimiento es un método útil para la generación de células iPS, ya que permite el control de la expresión del transgen durante el proceso de reprogramación. Aunque el uso de virus en la generación de células iPS impide el uso de estas células en un entorno clínico, este procedimiento nos permite responder a algunas de las principales cuestiones biológicas que subrayan el proceso de reprogramación aún no definida.

<table><tbody><tr><td>Doxiciclina hiclato</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

la generación de células ips a partir de mefs través de la expresión forzada de sox-2, oct-4, c-myc y klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotencia puede ser inducida en murino diferenciados por la transducción viral de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Hemos diseñado una estrategia de reprogramación en el que estos cuatro factores de transcripción se expresan de doxiciclina (Dox)-inducible vectores lentivirus (Brambrink et al., 2008). El uso de estas construcciones inducible, se puede derivar células madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). En este vídeo, que muestran el procedimiento para la generación de los lentivirus inducible que expresan los cuatro factores de transcripción y muestran cómo infectar MEFs con estos virus con el fin de producir células iPS. Mediante el uso de los lentivirus inducible, la expresión de los cuatro factores en el control de la adición de doxiciclina al medio de cultivo. La ventaja de este sistema a través de la infección retroviral tradicional es la capacidad de convertir los genes dentro y fuera de lo que la cinética de la reprogramación y las necesidades de expresión de genes puede ser analizado en detalle.

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

La pluripotencia puede inducirse en células murinas diferenciadas mediante la transducción viral de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

Hace más de 50 años, se planteó la hipótesis de que células diferenciadas terminalmente, como los fibroblastos de la piel, podrían ser inducidas a adoptar un estado pluripotente similar al de las células madre embrionarias. La base de este concepto radica en la observación de que todos los tipos celulares, con algunas excepciones menores, poseen el mismo código genético y que la única diferencia entre ellos consiste en la forma en que se lee dicho código. Esta capacidad de cambiar la identidad celular de una célula diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular.Después de medio decenio de investigación, recientemente se demostró que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción puede reprogramar fibroblastos de la piel para convertirlos en pluripotentes. El impacto de este hallazgo es enorme. Más allá de su importancia para la biología básica, también supera las principales objeciones éticas al uso de células madre embrionarias humanas en terapias de trasplante.Para que ocurra la reprogramación, es necesario empaquetar cuatro genes que codifican los factores de transcripción OC4, Sox2, c-Myc y K4 y colocarlos en un cultivo de tejidos de lentivirus. Luego, se añade al plato de cultivo celular, que contiene una alta densidad de fibroblastos, un medio que contiene el virus purificado, y dentro de ese plato ocurre algo asombroso. Una pequeña fracción de los fibroblastos se infecta con los cuatro virus portadores de los factores de transcripción y comienza a desdiferenciarse.Sufren cambios drásticos en su morfología y proliferación, y comienzan a dividirse en grandes cúmulos esféricos formados por células madre pluripotentes. Después de dos o tres semanas de cultivo en condiciones de células madre embrionarias, las colonias de fibroblastos reprogramados pueden aislarse manualmente y expandirse in vitro. Una vez purificadas, estas células pueden utilizarse para generar ratones quiméricos, en los cuales un determinado porcentaje de células derivadas de los fibroblastos desdiferenciados puede contribuir a distintos tejidos del ratón.En quimeras en las que el material genético de los fibroblastos originales ha contribuido a la línea germinal, el código genético puede transmitirse a la siguiente generación, y luego a la siguiente, y a la siguiente. Aunque el uso de un sistema de entrega viral constituye actualmente un impedimento para las aplicaciones clínicas, es probable que esto se supere en breve. En este video, miembros del laboratorio de Yin demostrarán cómo se derivan las células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos embrionarios de ratón.Hola, soy Grant Welted del laboratorio de Rudolph Jish en el Whitehead Institute for Biomedical Research en Cambridge, Massachusetts. Y yo soy Tobias Bro brink, también del laboratorio de Işh. Hoy les mostraremos la generación de células madre pluripotentes inducidas mediante la introducción de cuatro ADNc: OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4, utilizando virus lentivirales que expresan estos cuatro ADNc a partir de un promotor Tet-OCMV.Esto permite el control preciso de la expresión de estos cuatro transgenes tras la infección de fibroblastos embrionarios de ratón. El protocolo que les mostramos hoy implica el manejo de lentivirus que posiblemente pueda infectar células humanas. Es fundamental que siempre siga los procedimientos seguros y que contacte a su oficina de seguridad antes de intentar realizar esto por su cuenta.Entonces, generemos algunas células IPS para producir lentivirus que convertirán las células mes en células IPS. Las células 293 deben transfectarse con tres plásmidos: Paks dos, que proporciona los elementos genéticos necesarios para el empaquetamiento viral; el armazón viral, que es un lentivirus FUW TE OCMV con uno de los cuatro CD aids T cuatro SOX dos, KLA cuatro o CMIC; y PMDG, que expresa la glucoproteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular o VSV.Esto produce el virus que generará el virus atrópico. Por lo tanto, es necesario seguir los procedimientos adecuados de nivel de bioseguridad 2 más. En este video en particular, no estamos manipulando virus infecciosos, por lo que no llevamos puestas nuestras batas típicas ni nos encontramos en nuestras instalaciones de nivel de bioseguridad 2 más.Antes de la transfección 2, las células 9 3 se descongelan del nitrógeno líquido y se cultivan hasta alcanzar una confluencia del 90 %. Luego, las células se transfectan con el gen FU y se incuban entre 48 y 72 horas para permitir la expresión del virus. En ese momento, el medio que baña las células se filtra mediante un filtro de 0,45 micrones y se concentra mediante ultracentrifugación tras concentrar el virus. Ahora estamos listos para infectar las MES con el fin de generar agrupaciones de IPS. Durante los pasos de preparación del virus, los fibroblastos embrionarios de ratón con menos de tres pasajes se cultivan hasta alcanzar una confluencia del 90 % en placas de 10 centímetros, aproximadamente dos veces 10 a la seis células por placa. En este protocolo experimental específico, estamos utilizando MES que expresan la RTTA, lo cual es fundamental para la expresión de doxiciclina y GFP a partir del locus endógeno OC cuatro.Las MES son GFP negativas, pero las verdaderas células IPS se vuelven GFP positivas. Este marcador permite un método para identificar las células reprogramadas. Aspire el medio de cultivo de los fibroblastos y lave con 10 mL de PBS con EDTA, deseche el PBS con EDTA y agregue cinco mL de tripsina 1X e incube a 37 grados durante 10 minutos. La tripsina ayudará a desprender las células del fondo de las placas.Ahora agregue nueve mililitros del medio de cultivo para resuspender las células en una suspensión de células individuales y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. Luego, estas células se centrifugan y se forman en un pellet. Después de resuspender el pellet, se cuenta el número de células en la suspensión y se ajusta la concentración a ocho por diez a la cuatro células por mililitro.Se transfieren 10 mililitros de la suspensión celular a una placa de 10 centímetros recubierta con gelatina. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO₂; tras la incubación nocturna, se aspira el medio de una placa de fibroblastos y se añaden 10 mililitros del medio que contiene el virus al meto. Incube las células durante cuatro horas hasta toda la noche a 37 grados Celsius, 5 %CO₂.Al día siguiente, aspire el medio de un plato de fibroblastos y luego agregue 10 mililitros de medio ESL fresco. En esta etapa, las células pueden congelarse, expandirse o prepararse para la iniciación de la reprogramación. Para iniciar la reprogramación, sustituya el medio ESL regular por medio que contenga doxiciclina para iniciar la expresión de los cuatro genes.Coloque estas células en el incubador y cambie el medio cada día hasta que las colonias sean lo suficientemente grandes como para ser seleccionadas. Las colonias deben volverse visibles aproximadamente una semana después del inicio de la reprogramación. Deben alcanzar un tamaño adecuado para ser seleccionadas alrededor del día 20.Transcurridos ya 20 días, podemos proceder a seleccionar colonias IPS antes de realizar la selección de colonias. Se debe recordar verificar el número requerido de placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina y tratadas con irradiación gamma de DR cuatro mitos una o dos horas antes de la selección. Se deben alimentar las colonias en las placas añadiendo medio fresco justo antes de la selección; añada 50 microlitros de tampón HEPA a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en V inmediatamente antes de la selección, lave una vez el recipiente que contiene las colonias a seleccionar con PBS y añada 10 ml de PBS al recipiente. Los agregados celulares IPS pueden seleccionarse bajo un microscopio estereoscópico o un microscopio invertido.Seleccione las colonias con una punta de pipeta pequeña y transfiéralas a un pocillo de la placa de 96 pocillos que contenga PBS para eliminar los agregados. Se traza un círculo con la punta de la pipeta alrededor del agregado para deshacer los cúmulos. Ahora se pueden extraer las células reprogramadas utilizando la pipeta multicanal; se añaden 20 microlitros de tripsina a cada uno.Pipetee arriba y abajo tres veces, incube a 37 °C durante cuatro minutos. Después de la incubación de cuatro minutos, se añaden 100 µL de medio ES a las colonias tripps nice. Pipetee arriba y abajo 10 veces y transfiera seis clones a la vez.Desde la placa de 96 pocillos hasta una placa de 24 pocillos, utilizando una punta en cada posición alternada del pipetador de 12 posiciones, luego se cultivan las células en la placa de 24 pocillos en un incubador a 37 grados centígrados y 5 % de CO₂ hasta que las células alcancen entre el 80 y el 90 % de confluencia. Renueve con medio para células ES. Las células probablemente estarán listas para expandirse en tres a siete días. Unos días después, ahora que las células IPS están confluentes, aspire el medio y lave las células con un mililitro de HEPES. Elimine completamente el HEPES y agregue 100 microlitros de tripsina 1X e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Tras la incubación con tripsina, agregue 400 microlitros de medio ESL y suspenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales.La suspensión de células individuales de 500 microlitros procedente de la placa de 24 pocillos se transfiere entonces a un solo pocillo de una placa de seis pocillos y se incuba en un incubador a 37 grados Celsius con 5 %CO2 hasta que las células alcancen una confluencia del 80 al 90 % en la placa de seis pocillos. En este momento, puede proceder a amplificar las células para análisis Southern, cultivos de blastocitos, inyecciones, ensayos de teratoma o ensayos de diferenciación in vitro. Y debe recordar congelar alícuotas de reserva de estas células para no perder este valioso stock de células IPS.Acabamos de mostrarle cómo inducir pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón utilizando un sistema antiviral inducible. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Biología

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

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Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

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Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

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Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

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