La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

Hace más de 50 años, se planteó la hipótesis de que las células terminalmente diferenciadas, como los fibroblastos de la piel, podrían verse obligadas a adoptar un estado pluripotente similar al de las células madre embrionarias. La base de este concepto fue la observación de que todos los tipos de células, con algunas excepciones menores, tienen el mismo código genético y que la única diferencia entre los tipos de células es cómo se lee el código. Esta capacidad de cambiar la identidad celular de una célula diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular.

Después de media década de investigación, recientemente se demostró que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción puede reprogramar los fibroblastos de la piel para que se vuelvan pluripotentes. El impacto de este hallazgo es enorme. Más allá de la importancia para la biología básica, también supera las principales objeciones éticas al uso de células madre embrionarias humanas para la terapia de trasplante.

Para que se produzca la reprogramación, es necesario empaquetar cuatro genes que codifican los factores de transcripción OC, cuatro, sox, dos, cmic y K, cuatro, y colocarlos en un cultivo de tejido de lentivirus. A continuación, se añade un medio que contiene un virus purificado a una placa de cultivo celular que contiene una alta densidad de fibroblastos, y dentro de esa placa se produce algo sorprendente. Una pequeña fracción de los fibroblastos se infecta con los cuatro virus portadores del factor de transcripción y comienza a diferenciarse.

Sufren cambios drásticos en su morfología y proliferación, y comienzan a dividirse en grandes grupos espirituales de células madre pluripotentes formadas. Después de dos o tres semanas de cultivo en condiciones de células madre embrionarias, las colonias de fibroblastos reprogramados se pueden aislar manualmente y expandir in vitro. Una vez purificadas, estas células se pueden utilizar para generar ratones quiméricos en los que un cierto porcentaje de células derivadas de esos fibroblastos desdiferenciados pueden contribuir a diferentes tejidos del ratón.

En las campanadas en las que el material genético de los fibroblastos originales ha contribuido a la línea germinal, el código genético se transmite a la siguiente generación y luego a la siguiente y luego a la siguiente. Aunque el uso de un sistema de administración viral es actualmente un impedimento para las aplicaciones clínicas, es probable que esto se supere en poco tiempo. En este video, los miembros del laboratorio yin demostrarán cómo se derivan potentes células madre inducidas a partir de fibroblastos embrionarios de ratón.

Hola, soy Grant Welted y trabajo del laboratorio de Rudolph Jish en el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica en Cambridge, Massachusetts. Y yo soy Tobias Bro brink también de ish lab. Hoy os mostraremos la generación de células madre pluripotentes inducidas mediante la introducción de cuatro CDNAs, OCTA, cuatro SOX, dos CIC, KF, cuatro utilizando lentivirus, que expresan estas cuatro CDNAs a partir de un promotor Tet OCMV.

Esto permite el control preciso de la expresión de estos cuatro transgenes después de la infección de fibroblastos embrionarios de ratón. El protocolo que te mostramos hoy implica el manejo de lentivirus que posiblemente puedan infectar células humanas. Es fundamental que siempre siga los procedimientos seguros y se comunique con su oficina de seguridad antes de intentar hacerlo usted mismo.

Así que vamos a generar algunas células IPS con el fin de generar lentivirus que convertirán las células mes en células IPS. 2 9 3 células deben ser transfectadas con tres plásmidos Paks dos, que proporcionan los elementos genéticos necesarios para el empaquetamiento viral. La columna vertebral viral, que es un lentivirus FUW TE OCMV con una de las cuatro ayudas CD T cuatro SOX dos, KLA cuatro o CMIC PMDG, que expresa la glicoproteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular o VSV.

Esto hace que el virus que generará el virus atrópico. Por lo tanto, se deben seguir los procedimientos adecuados de BL dos plus. En este video en particular, en realidad no estamos manejando un virus infeccioso, por lo que no estamos usando nuestras batas típicas y no estamos en nuestras instalaciones BL two plus.

Antes de la transfección 2, se descongelan 9 3 células de nitrógeno líquido y se cultivan hasta un 90% de fluidez. A continuación, las células se transfectan con el gen FU y se les da de 48 a 72 horas para expresar el virus, momento en el que el medio que baña las células se filtra con un filtro de 0,45 micras y se concentra mediante ultracentrifugación después de concentrar el virus. Ahora estamos listos para infectar MES con el fin de generar grupos de IPS Durante los pasos de preparación viral, los fibroblastos embrionarios de ratón pasan menos de tres veces se cultivan hasta el 90% de fluidez en placas de 10 centímetros, aproximadamente dos veces 10 a las seis células por placa. En este protocolo experimental en particular, estamos utilizando MES que expresan el RTTA, que es crítico para la expresión de doxiciclina y GFP del locus endógeno OC cuatro.

Los MES son GFP negativos, pero las verdaderas células IPS se convierten en GFP positivas. Este marcador permite un método mediante el cual se pueden identificar los mes reprogramados, aspirar el medio de cultivo de los fibroblastos y lavar con 10 milésimas de pulgada de hippies, EDTA, desechar los hippies EDTA y añadir cinco milésimas de pulgada de tripsina una vez e incubar a 37 grados durante 10 minutos. La tripsina ayudará a levantar las células del fondo de los platos.

Ahora agregue nueve milésimas de pulgada del medio de cultivo para resuspender las células en una suspensión de una sola célula y transfiéralas a un tubo de 15 milésimas de pulgada. A continuación, estas células se centrifugan y se granulan. Después de suspender el pellet, se cuenta el número de celdas en la suspensión y la concentración se ajusta a ocho veces 10 por las cuatro celdas por mil.

A continuación, se transfieren 10 milésimas de pulgada de la suspensión celular a un plato de 10 centímetros cubierto de gelatina. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados, 5% de CO2 después de la incubación durante la noche, se aspira el medio de una placa de fibroblastos y se agregan 10 milésimas de pulgada del medio que contiene el virus a la metanfetamina. Incubar las células desde cuatro horas hasta toda la noche a 37 grados centígrados, 5% de CO2.

Al día siguiente, aspire el medio de una placa de chorro de fibra y luego agregue 10 milésimas de pulgada de medio ESL fresco. En esta etapa, las células pueden congelarse, expandirse o prepararse para el inicio de la reprogramación. Para iniciar la reprogramación, reemplace el medio ESL regular con un medio que contenga doxiciclina para iniciar la expresión de los cuatro genes.

Coloque estas celdas en la incubadora, cambie el medio todos los días hasta que las colonias sean lo suficientemente grandes como para ser recogidas. Las colonias deben hacerse visibles por primera vez aproximadamente una semana después del inicio de la reprogramación. Deben ser lo suficientemente grandes como para ser recogidos alrededor del día 20.

Ahora que han pasado 20 días, podemos seguir adelante y elegir colonias IPS antes de elegir colonias. Uno debe recordar ver el número requerido de placas de 24 pocillos recubiertas de gelatina con DR 4 mitos irradiados con rayos gamma una o dos horas antes de la recolección. Se debe alimentar las colonias en los platos agregando medio fresco justo antes de la recolección, agregar 50 microlitros de tampón HEPA a los pocillos de un plato de 96 pocillos con fondo en V inmediatamente antes de recolectar, lavar el plato que contiene las colonias que se van a recoger una vez con PBS y agregar 10 ml de PBS al plato. Los grupos de células IPS se pueden seleccionar bajo un microscopio estéreo o invertido.

Recoja las colonias con una pequeña punta de pipeta y transfiéralas a un pocillo en el plato de 96 pocillos que contiene PBS para eliminar los racimos. Se dibuja un círculo con la punta de una pipeta alrededor del grupo para dividir las matemáticas. Ahora se pueden extraer las celdas reprogramadas, ahora usando el pipetero multicanal, se agregan 20 microlitros de tripsina a cada una.

Bueno, cásalo hacia arriba y hacia abajo tres veces, incuba a 37 grados C durante cuatro minutos. Después de la incubación de cuatro minutos, se añaden 100 microlitros de medio ES a las colonias de tripps. Canaliza hacia arriba y hacia abajo 10 veces y transfiere seis clones a la vez.

De la placa de 96 pocillos a una placa de 24 pocillos usando una punta en cada otra posición en las celdas de pipeteo de 12 lugares, luego se cultivan en la placa de 24 pocillos en una incubadora de 37 centavos de grado, 5% de CO2 hasta que las celdas alcanzan el 80 a 90% de fluidez que se ajusta a la deli con células ES, las celdas de medio probablemente estarán listas para expandirse en tres a siete días unos días después. Ahora que las células IPS son confluentes, aspire el medio y lave las células con una milésima de pulgada de hippies completamente Retire los hippies y agregue 100 microlitros de tripsina una vez e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación con tripsina, agregue 400 microlitros de medio ESL y suspenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y produzca una suspensión de una sola célula.

La suspensión de una sola celda de 500 microlitros de los 24 pocillos se transfiere a un solo pocillo de una placa de seis pocillos y se incuba en una incubadora de 5% de CO2 a 37 grados Celsius hasta que las celdas alcanzan una fluidez de 80 a 90% en la placa de seis pocillos. En este punto, puede proceder a amplificar las células para análisis de sur, blastos, inyecciones, ensayos de teratomas o ensayos de diferenciación in vitro. Y debe recordar congelar las válvulas de stock de estas celdas para no perder este precioso stock de celdas IPS.

Acabamos de mostrarte cómo inducir pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón utilizando un sistema antiviral inducible. Así que gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.