La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

Hace más de 50 años, se planteó la hipótesis de que células diferenciadas terminalmente, como los fibroblastos de la piel, podrían ser inducidas a adoptar un estado pluripotente similar al de las células madre embrionarias. La base de este concepto radica en la observación de que todos los tipos celulares, con algunas excepciones menores, poseen el mismo código genético y que la única diferencia entre ellos consiste en la forma en que se lee dicho código. Esta capacidad de cambiar la identidad celular de una célula diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular.

Después de medio decenio de investigación, recientemente se demostró que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción puede reprogramar fibroblastos de la piel para convertirlos en pluripotentes. El impacto de este hallazgo es enorme. Más allá de su importancia para la biología básica, también supera las principales objeciones éticas al uso de células madre embrionarias humanas en terapias de trasplante.

Para que ocurra la reprogramación, es necesario empaquetar cuatro genes que codifican los factores de transcripción OC4, Sox2, c-Myc y K4 y colocarlos en un cultivo de tejidos de lentivirus. Luego, se añade al plato de cultivo celular, que contiene una alta densidad de fibroblastos, un medio que contiene el virus purificado, y dentro de ese plato ocurre algo asombroso. Una pequeña fracción de los fibroblastos se infecta con los cuatro virus portadores de los factores de transcripción y comienza a desdiferenciarse.

Sufren cambios drásticos en su morfología y proliferación, y comienzan a dividirse en grandes cúmulos esféricos formados por células madre pluripotentes. Después de dos o tres semanas de cultivo en condiciones de células madre embrionarias, las colonias de fibroblastos reprogramados pueden aislarse manualmente y expandirse in vitro. Una vez purificadas, estas células pueden utilizarse para generar ratones quiméricos, en los cuales un determinado porcentaje de células derivadas de los fibroblastos desdiferenciados puede contribuir a distintos tejidos del ratón.

En quimeras en las que el material genético de los fibroblastos originales ha contribuido a la línea germinal, el código genético puede transmitirse a la siguiente generación, y luego a la siguiente, y a la siguiente. Aunque el uso de un sistema de entrega viral constituye actualmente un impedimento para las aplicaciones clínicas, es probable que esto se supere en breve. En este video, miembros del laboratorio de Yin demostrarán cómo se derivan las células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos embrionarios de ratón.

Hola, soy Grant Welted del laboratorio de Rudolph Jish en el Whitehead Institute for Biomedical Research en Cambridge, Massachusetts. Y yo soy Tobias Bro brink, también del laboratorio de Işh. Hoy les mostraremos la generación de células madre pluripotentes inducidas mediante la introducción de cuatro ADNc: OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4, utilizando virus lentivirales que expresan estos cuatro ADNc a partir de un promotor Tet-OCMV.

Esto permite el control preciso de la expresión de estos cuatro transgenes tras la infección de fibroblastos embrionarios de ratón. El protocolo que les mostramos hoy implica el manejo de lentivirus que posiblemente pueda infectar células humanas. Es fundamental que siempre siga los procedimientos seguros y que contacte a su oficina de seguridad antes de intentar realizar esto por su cuenta.

Entonces, generemos algunas células IPS para producir lentivirus que convertirán las células mes en células IPS. Las células 293 deben transfectarse con tres plásmidos: Paks dos, que proporciona los elementos genéticos necesarios para el empaquetamiento viral; el armazón viral, que es un lentivirus FUW TE OCMV con uno de los cuatro CD aids T cuatro SOX dos, KLA cuatro o CMIC; y PMDG, que expresa la glucoproteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular o VSV.

Esto produce el virus que generará el virus atrópico. Por lo tanto, es necesario seguir los procedimientos adecuados de nivel de bioseguridad 2 más. En este video en particular, no estamos manipulando virus infecciosos, por lo que no llevamos puestas nuestras batas típicas ni nos encontramos en nuestras instalaciones de nivel de bioseguridad 2 más.

Antes de la transfección 2, las células 9 3 se descongelan del nitrógeno líquido y se cultivan hasta alcanzar una confluencia del 90 %. Luego, las células se transfectan con el gen FU y se incuban entre 48 y 72 horas para permitir la expresión del virus. En ese momento, el medio que baña las células se filtra mediante un filtro de 0,45 micrones y se concentra mediante ultracentrifugación tras concentrar el virus. Ahora estamos listos para infectar las MES con el fin de generar agrupaciones de IPS. Durante los pasos de preparación del virus, los fibroblastos embrionarios de ratón con menos de tres pasajes se cultivan hasta alcanzar una confluencia del 90 % en placas de 10 centímetros, aproximadamente dos veces 10 a la seis células por placa. En este protocolo experimental específico, estamos utilizando MES que expresan la RTTA, lo cual es fundamental para la expresión de doxiciclina y GFP a partir del locus endógeno OC cuatro.

Las MES son GFP negativas, pero las verdaderas células IPS se vuelven GFP positivas. Este marcador permite un método para identificar las células reprogramadas. Aspire el medio de cultivo de los fibroblastos y lave con 10 mL de PBS con EDTA, deseche el PBS con EDTA y agregue cinco mL de tripsina 1X e incube a 37 grados durante 10 minutos. La tripsina ayudará a desprender las células del fondo de las placas.

Ahora agregue nueve mililitros del medio de cultivo para resuspender las células en una suspensión de células individuales y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. Luego, estas células se centrifugan y se forman en un pellet. Después de resuspender el pellet, se cuenta el número de células en la suspensión y se ajusta la concentración a ocho por diez a la cuatro células por mililitro.

Se transfieren 10 mililitros de la suspensión celular a una placa de 10 centímetros recubierta con gelatina. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO₂; tras la incubación nocturna, se aspira el medio de una placa de fibroblastos y se añaden 10 mililitros del medio que contiene el virus al meto. Incube las células durante cuatro horas hasta toda la noche a 37 grados Celsius, 5 %CO₂.

Al día siguiente, aspire el medio de un plato de fibroblastos y luego agregue 10 mililitros de medio ESL fresco. En esta etapa, las células pueden congelarse, expandirse o prepararse para la iniciación de la reprogramación. Para iniciar la reprogramación, sustituya el medio ESL regular por medio que contenga doxiciclina para iniciar la expresión de los cuatro genes.

Coloque estas células en el incubador y cambie el medio cada día hasta que las colonias sean lo suficientemente grandes como para ser seleccionadas. Las colonias deben volverse visibles aproximadamente una semana después del inicio de la reprogramación. Deben alcanzar un tamaño adecuado para ser seleccionadas alrededor del día 20.

Transcurridos ya 20 días, podemos proceder a seleccionar colonias IPS antes de realizar la selección de colonias. Se debe recordar verificar el número requerido de placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina y tratadas con irradiación gamma de DR cuatro mitos una o dos horas antes de la selección. Se deben alimentar las colonias en las placas añadiendo medio fresco justo antes de la selección; añada 50 microlitros de tampón HEPA a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en V inmediatamente antes de la selección, lave una vez el recipiente que contiene las colonias a seleccionar con PBS y añada 10 ml de PBS al recipiente. Los agregados celulares IPS pueden seleccionarse bajo un microscopio estereoscópico o un microscopio invertido.

Seleccione las colonias con una punta de pipeta pequeña y transfiéralas a un pocillo de la placa de 96 pocillos que contenga PBS para eliminar los agregados. Se traza un círculo con la punta de la pipeta alrededor del agregado para deshacer los cúmulos. Ahora se pueden extraer las células reprogramadas utilizando la pipeta multicanal; se añaden 20 microlitros de tripsina a cada uno.

Pipetee arriba y abajo tres veces, incube a 37 °C durante cuatro minutos. Después de la incubación de cuatro minutos, se añaden 100 µL de medio ES a las colonias tripps nice. Pipetee arriba y abajo 10 veces y transfiera seis clones a la vez.

Desde la placa de 96 pocillos hasta una placa de 24 pocillos, utilizando una punta en cada posición alternada del pipetador de 12 posiciones, luego se cultivan las células en la placa de 24 pocillos en un incubador a 37 grados centígrados y 5 % de CO₂ hasta que las células alcancen entre el 80 y el 90 % de confluencia. Renueve con medio para células ES. Las células probablemente estarán listas para expandirse en tres a siete días. Unos días después, ahora que las células IPS están confluentes, aspire el medio y lave las células con un mililitro de HEPES. Elimine completamente el HEPES y agregue 100 microlitros de tripsina 1X e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Tras la incubación con tripsina, agregue 400 microlitros de medio ESL y suspenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales.

La suspensión de células individuales de 500 microlitros procedente de la placa de 24 pocillos se transfiere entonces a un solo pocillo de una placa de seis pocillos y se incuba en un incubador a 37 grados Celsius con 5 %CO2 hasta que las células alcancen una confluencia del 80 al 90 % en la placa de seis pocillos. En este momento, puede proceder a amplificar las células para análisis Southern, cultivos de blastocitos, inyecciones, ensayos de teratoma o ensayos de diferenciación in vitro. Y debe recordar congelar alícuotas de reserva de estas células para no perder este valioso stock de células IPS.

Acabamos de mostrarle cómo inducir pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón utilizando un sistema antiviral inducible. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.